Optimale Schnittdicke für eine verbesserte Genauigkeit der quantitativen Analyse der Verteilung fluoreszierender Zellen und Mikrokügelchen im Kryo

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 10907 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Kryo-Bildgebung wurde effektiv eingesetzt, um die Bioverteilung fluoreszierender Zellen oder Mikrosphären in Tiermodellen zu untersuchen. Sequentielle schichtweise Fluoreszenzbildgebung ermöglicht die Erkennung fluoreszierender Zellen oder Mikrokügelchen zur entsprechenden Quantifizierung ihrer Verteilung im Gewebe. Wenn die Slices jedoch zu dünn sind, kommt es zu einer Datenüberlastung und zu langen Scanzeiten. Wenn die Scheiben zu dick sind, können Zellen fehlen. In dieser Studie haben wir ein Modell zur Erkennung fluoreszierender Zellen oder Mikrosphären entwickelt, um die optimale Bestimmung der Schichtdicke zu unterstützen. Zu den Schlüsselfaktoren gehören: Schnittdicke (X), Fluoreszenzzellintensität (Ifluo), effektiver Gewebeschwächungskoeffizient (μT) und eine Erkennungsschwelle (T). Das Modell schlägt einen optimalen Schichtdickenwert vor, der eine nahezu ideale Empfindlichkeit bietet und gleichzeitig die Scanzeit minimiert. Das Modell schlägt außerdem eine Korrekturmethode vor, um fehlende Zellen zu kompensieren, falls Bilddaten mit einer zu großen Schichtdicke erfasst wurden. Dieser Ansatz ermöglicht es Kryo-Bildgebungsbetreibern, eine größere Schichtdicke zu verwenden, um die Scanzeit ohne nennenswerten Verlust der Zellzahl zu verkürzen. Wir haben das Modell anhand realer Daten aus zwei unabhängigen Studien validiert: fluoreszierende Mikrokügelchen in einem Schweineherz und fluoreszierend markierte Stammzellen in einem Mausmodell. Die Ergebnisse zeigen, dass die Beziehungen zwischen Schichtdicke und Erkennungsempfindlichkeit aus Simulationen und realen Daten mit einer Korrelation von 99 % und einem RMS-Fehler (Root-Mean-Square) von 2 % gut übereinstimmten. Wir diskutierten auch die Erkennungseigenschaften in Situationen, in denen wichtige Annahmen des Modells nicht erfüllt waren, wie z. B. Variation der Fluoreszenzintensität und räumliche Verteilung. Abschließend zeigen wir, dass die Kryo-Bildgebung mit den richtigen Einstellungen eine genaue Quantifizierung der fluoreszierenden Zellbioverteilung mit bemerkenswert hohen Wiederherstellungsraten (Anzahl der Erkennungen/Lieferung) ermöglichen kann. Da die Kryo-Bildgebungstechnologie in vielen biologischen Anwendungen eingesetzt wird, können unsere Methoden zur optimalen Schichtdickenbestimmung und Datenkorrektur eine entscheidende Rolle bei der weiteren Verbesserung ihrer Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit spielen.

Kryo-Bildgebung ist eine 3D-mikroskopische Bildgebungstechnologie, die die Lokalisierung fluoreszierender Zellen überall in einer ganzen Maus oder Ratte mit Einzelzellsensitivität ermöglicht1,2,3,4,5,6,7,8,9. Das System besteht aus einem motorisierten Mikrotom-Kryostat, einem Mikroskop mit Hellfeld- und Fluoreszenzkapazität, einem Roboterpositionierer und Steuersoftware. Zur Durchführung der Kryo-Bildgebung werden die interessierenden Gewebe mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und auf einem Schneidetisch fixiert, wobei abwechselndes Schneiden und Bildgeben durchgeführt wird. Das System erfasst gekachelte, große Sichtfelder, hochauflösende (~ 10 µm), farbige Hellfeld- und Fluoreszenzbilder des Gewebes. Durch Stapeln von Bildschnitten können 3D-Bildvolumina zur Visualisierung und Analyse der Bioverteilung generiert werden. Diese außergewöhnlichen Eigenschaften machen die Kryo-Bildgebung einzigartig im Vergleich zu anderen 3D-In-vivo-Modalitäten wie der Magnetresonanztomographie (MRT) oder der Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Solche In-vivo-Bildgebungsmodalitäten können zwar ein ganzes Tier abbilden, ihnen fehlt jedoch die ausreichende Auflösung und sie können nur Graustufenbilder erzeugen. Mit den oben genannten Merkmalen schließt die Kryo-Bildgebung eine kritische Lücke in anderen Bildgebungsmodalitäten für die biologische Forschung.

Kryo-Bildgebung wurde verwendet, um die Bioverteilung fluoreszierender Zellen oder Mikrosphären in verschiedenen Tiermodellen zu untersuchen, darunter kleine Nagetiere2,3,4,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20, Hunde7,21, Schweine5,22,23 und andere Tiermodelle24. Burden-Gulley et al.13,14,15 verwendeten Kryo-Bildgebung, um wanderndes und invasives Verhalten von Glioblastomzellen in einem Mausmodell zu visualisieren. Kürzlich haben wir eine auf Kryo-Bildgebung basierende Plattform entwickelt, um fluoreszierende Metastasen im gesamten Mauskörper zu quantifizieren und zu bewerten4,17,18,19. Es wurde festgestellt, dass die Plattform für die Bewertung und Optimierung von Pipelines von Technologien (Bildgebungsmittel, Bildgebungsverfahren, Therapeutika, Tumormodelle usw.) geeignet ist, die für die Erkennung, das Verständnis und die Behandlung von metastasiertem Krebs unerlässlich sind. Viele Gruppen7,8,24,25, darunter auch unsere eigene5,26, nutzten die Technologie zur räumlichen Auflösung quantitativer, hochauflösender 3D-Myokardperfusion über die Methode des Einschlusses fluoreszierender Mikrokügelchen. Van Horssen bei el. nutzte die Technologie auch zur Visualisierung der Bioverteilung sowohl von fluoreszierenden Mikrokügelchen7,21,22,23,27 als auch von fluoreszierend markierten Monozyten6, um die Eigenschaften des Fortschreitens der koronaren Neovaskularisation in Tierherzen zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir zuvor die Kryo-Bildgebungstechnologie eingesetzt, um die Bioverteilung von intravenös injizierten Stammzellen und krankheitsauslösenden Immunzellen im gesamten Körper in einem Mausmodell mit Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD) zu untersuchen2,3,9,10,11,12 ,20,28,29. Beispiele für die Fluoreszenzbilder, die die Mikrosphärensignale und die Stammzellsignale zeigen, sind im Ergänzungsdokument aufgeführt. Angesichts des großen Nutzens der Kryo-Bildgebung in der biomedizinischen Bildgebungsforschung gibt es immer zahlreichere Anwendungen, die diese Technologie nutzen.

Obwohl die Kryo-Bildgebung weit verbreitet ist, wurde der optimale Wert der Schichtdicke bisher nicht identifiziert. In einigen Experimenten, die die Abbildung eines dicken Gewebes erfordern (z. B. Schweineherz), wird häufig ein großer Wert für die Schnittdicke (z. B. X > 100 µm) gewählt. Zu den Vorteilen einer größeren Schnittdicke gehören schnellere Bildgebungs- und Rechenzeiten, weniger Speicherverbrauch und eine längere Lebensdauer des Schnittmessers. Signale von schwach fluoreszierenden Zellen, die in dickem Gewebe eingebettet sind, erreichen jedoch möglicherweise nicht die Oberfläche und werden vom Bildgebungssystem möglicherweise nicht erkannt. Die Physik des Signalverlusts kann durch die Prinzipien der Lichtabsorption und -streuung im biologischen Gewebe beschrieben werden30,31,32,33. Im Allgemeinen ist bei einer zu großen Schichtdicke mit einer erheblichen Rate an falsch-negativen Ergebnissen zu rechnen. Dies würde die Ergebnisse unzuverlässig machen, insbesondere bei Anwendungen, die eine genaue absolute Quantifizierung erfordern. Wenn man andererseits die Schichtdicke zu klein einstellt, wäre zwar eine genaue Quantifizierung möglich, aber weder rechentechnisch noch wirtschaftlich effizient. Beispielsweise dauert es drei Tage (72 Stunden), um ein Gewebe, das über Nacht (12 Stunden) bei einer Schichtdicke von 120 µm abgebildet werden kann, bei 20 µm zu scannen. Es wird erwartet, dass es einen optimalen Wert für die Schichtdicke gibt, der eine genaue Zell-/Mikrosphärenzählung bei angemessener Scanzeit ermöglicht.

In dieser Studie schlagen wir ein Modell zur Schätzung der optimalen Schichtdicke vor, bei der es sich um die dickste Schicht handelt, die genaue Zellzahlen aufrechterhält. Wir validieren das Modell anhand von Daten und bestimmen erstmals den Zusammenhang zwischen Schichtdicke und Erkennbarkeit. Anschließend vergleichen wir die Ergebnisse zwischen simulierten Daten und realen Daten, um den Grad ihrer Korrelation zu bestimmen.

Das Modell wurde hauptsächlich auf der Grundlage einer früheren Studie zur Entfernung von Fluoreszenzsignalen außerhalb der Ebene entwickelt34. Es wird angenommen, dass fluoreszierende Zellen in ein homogenes Gewebevolumen eingebettet sind (Abb. 1). Bei der Kryo-Bildgebung wird die oberste dünne Schicht des Volumens abgeschnitten. Anschließend werden mittels Epifluoreszenzbildgebung Bilder der verbleibenden Blockfläche aufgenommen, wobei die erfasste Signalintensität anhand der optischen Eigenschaften des Gewebes bestimmt wird. Das Modell zielt darauf ab, zu bestimmen, ob das Bildgebungssystem Signale der fluoreszierenden Zellen unterhalb der freiliegenden Oberfläche (Blockfläche) erkennen kann oder nicht.

Epifluoreszenz-Bildgebungsmodell. Abbildung (A) zeigt, dass eine fluoreszierend markierte Zelle (gelber Kreis) in ein homogenes Gewebe (grüner Kasten) eingebettet ist. Anregungs-/einfallendes Licht einer Fluoreszenzlichtquelle wandert von einem Mikroskop oben (orangefarbenes Trapez) und interagiert dann mit dem Fluorophor der Zellen. Das emittierte Licht wandert zurück zur Kamera, wo anhand eines Erkennungsschwellenwerts festgestellt wird, ob das Zellsignal erkannt wird oder nicht. Das Modell kann weiter zu Abbildung (B) vereinfacht werden.

Nehmen wir an, dass Photonen einer Fluoreszenzlichtquelle mit einer Intensität I0 auf die Probenblockfläche einfallen (Abb. 1). An der Luft-Proben-Grenzfläche wird ein Teil des einfallenden Lichts in das Gewebe übertragen, Tat, abhängig vom Brechungsindex der Blockfläche. Anregungsphotonen, die in die Probe eindringen, werden absorbiert und mit einem effektiven Gewebeschwächungskoeffizienten μex (cm−1) in das Gewebe gestreut. Durchgelassene Photonen dringen weiter durch das Gewebe, bis sie in der Tiefe x unter der Oberfläche auf ein Fluorophor treffen. Ein Bruchteil F dieser einfallenden Photonen wird vom Fluorophor absorbiert und führt zu einer Fluoreszenzemission von Photonen mit niedrigerer Energie (Stokes-Verschiebung) in Richtung des Bildgebungssystems. Die emittierten Photonen werden im Gewebe mit einem anderen effektiven Gewebeschwächungskoeffizienten μem (cm−1) gestreut und absorbiert, und ein Prozentsatz wird an der Gewebe-Luft-Grenzfläche, Tta, übertragen. Das am Detektor detektierte Fluoreszenzsignal hat die Intensität I(x). Daher wird die Fluoreszenzintensität I(x), die von einem Fluorophor in einer Gewebetiefe x emittiert wird, beschrieben durch:

Unter der Annahme, dass μT = μex + μem und Ifluo = I0TatFTta, können wir das Modell weiter vereinfachen zu:

Dabei ist I(x) die von der Kamera erfasste Intensität, Ifluo die Intensität des fluoreszierenden Photons, das von den Fluorophoren ohne Abschwächung übertragen wird, und μT der Gesamtabschwächungskoeffizient des Gewebes (Abb. 1B). Im Gegensatz zu einigen früheren Berichten7,27,32 trennen wir in diesem vereinfachten Modell der Lichtausbreitung den Streubeitrag in Form der Punktspreizfunktion nicht explizit vom Dämpfungsterm. Vielmehr kombinieren wir die Auswirkungen der Lichtstreuung und der Gewebedämpfung in einem einzigen exponentiellen Term. Diese Annahme steht im Einklang mit dem Lambert-Beer-Gesetz und anderen 1D-Lichtausbreitungsmodellen in Gewebe31,33,34. Da wir nur die Intensitätsänderung entlang einer Geraden zwischen dem Kamerasystem und dem Zentrum des im Gewebe eingebetteten Fluorophors berücksichtigen, gibt es in unserem Modell nur einen räumlichen Parameter (x), der einen Abstand von der Oberfläche darstellt (x = 0). ) zum Fluorophor.

Damit das Signal der fluoreszierenden Zelle erkannt werden kann, muss die Intensität des emittierten Photons, das die Kamera erreicht, I(x), größer oder gleich einem Erkennungsschwellenwert T sein, was Folgendes ergibt:

Bei der Kryo-Bildgebung wird die Gewebeprobe alternativ in Scheiben geschnitten und mit einer festen Schnittdicke abgebildet1,2,4,10,15,18. Die Diagramme in Abb. 2 veranschaulichen, wie Kryobilder erfasst werden. Die Gewebeprobe, die eine fluoreszierende Zelle enthält, kann sich zwischen der Bildgebungsposition und der Schnittposition hin und her bewegen. Die Gewebeprobe kann um eine feste Länge von X angehoben und dann in Richtung eines scharfen Messers bewegt werden, um die oberste dünne Schicht abzuschneiden. Nach dem Schnitt wird die Probe zurück in die Aufnahmeposition bewegt, damit das Bild der Blockfläche aufgenommen werden kann. Der gesamte Slice-and-Image-Prozess wird wiederholt, bis die gesamte Probe verschwunden ist. Beachten Sie, dass das Fluoreszenzsignal einer fluoreszierenden Zelle tief in der Probe an der Blockfläche schwach sein kann (Abb. 2A). Da die Probe jedoch wiederholt angehoben, geschnitten und abgebildet wird, wird die Zellintensität an derselben Stelle in den Ausgabebildern zunehmend heller (Abb. 2C). Das Zellsignal verschwindet abrupt, wenn eine Gewebeschicht, die die Zelle enthält, durchtrennt wird (Abb. 2E). Daher können Signale einer einzelnen Zelle in mehreren Schnitten beobachtet werden, was zu einer Fluoreszenz unterhalb der Oberfläche führt.

Slice-and-Image-Operation in der Kryo-Bildgebung. Das Diagramm veranschaulicht, wie mit der Kryo-Bildgebung Blockflächenbilder erfasst werden. Eine Gewebeprobe (grüner Kasten), die eine fluoreszierende Zelle (gelber Kreis) enthält, wird auf einem Schneidtisch (blaue Strukturen) fixiert, der sich zwischen der Bildgebungsposition und der Schneidposition hin und her bewegen kann. Nachdem das erste Blockflächenbild von der Kamera oben (A) aufgenommen wurde, wird die Gewebeprobe um eine feste Länge von X angehoben und dann in Richtung eines scharfen Messers bewegt, um die oberste dünne Schicht (mit der Dicke von X) abzuschneiden. (B). Nach dem Schnitt wird die Probe zurück in die Aufnahmeposition bewegt, sodass das zweite Blockflächenbild aufgenommen werden kann (C). Der gesamte Slice-and-Image-Prozess wird wiederholt (D–E), bis die gesamte Probe verschwunden ist. Bitte beachten Sie, dass dieses Diagramm nicht maßstabsgetreu ist.

Wir führen in das Modell eine Schnittdicke X ein, die zwischen 1 und 300 µm variieren kann. (Als Referenz haben wir in vielen Experimenten X für die Bildgebung von Kleintieren auf einen Wert zwischen 20 und 40 µm eingestellt.) Unter Berücksichtigung der Gleichungen. (2)–(3) Es gibt vier Faktoren, die zur Erkennbarkeit des Fluorophorsignals beitragen: das Fluorophorsignal Ifluo (Graustufe), die Tiefe der Zelle relativ zur Blockflächenoberfläche x (μm), der Gewebeschwächungskoeffizient μT (cm−1) und die Erkennungsschwelle T (Graustufe) (Abb. 1). Betrachten Sie nun den Fall, dass die Fluorophore gleichmäßig im Gewebe verteilt sind, beginnend von der Tiefe x = 0 (am oberen Rand) bis x = X (am Rand des Abschnitts). Nach Gl. (2) Die Fluorophore mit der geringsten Intensität sind diejenigen, die sich am Boden der Schicht oder in der Tiefe x = X muss mindestens der Erkennungsschwelle entsprechen. Daher ist Gl. (3) wird:

In dieser Studie definieren wir die optimale Schnittdicke Xoptimal (μm) als die größte Schnittdicke, die garantiert, dass das System immer noch die schwächsten Signale von Fluorophoren erkennen kann, die sich im Gewebeschnitt befinden. In der Tiefe x = Xoptimal weisen die Fluorophore eine detektierte Intensität auf, die der Detektionsschwelle des Bildgebungssystems entspricht (Gl. (4). Wenn das Gewebe dicker als dieser Wert geschnitten wird, werden die Fluorophore am unteren Rand des Schnitts nicht erkannt. Durch Schneiden des Gewebes, das dünner als dieser Wert ist, können immer noch alle Fluorophore nachgewiesen werden, allerdings auf Kosten mechanischer Beeinträchtigungen, längerer Bildgebungszeit und anderer Kosten. Wir können die optimale Schichtdicke bestimmen, indem wir Gl. (4):

Interessanterweise schlägt das Modell auch die optimale Fluoreszenzintensität Ioptimal (Graustufe) vor, die die perfekte Erkennung der Fluoreszenzsignale für den Fall garantiert, dass die Schichtdicke festgelegt werden muss. Die optimale Fluoreszenzintensität ist die minimale Intensität der Fluoreszenzzellen, die sich am Boden der Schicht befinden (x = X), die vom Bildgebungssystem noch erkannt werden kann. Bei dieser oder einer höheren Intensität werden garantiert alle fluoreszierenden Zellen im Gewebeschnitt erkannt. Wenn die Zellen dunkler als dieser Wert sind, gehen die Fluoreszenzsignale am unteren Rand der Schicht verloren. Mit diesen Definitionen ist Gl. (4) wird:

Abbildung 3 veranschaulicht das Zusammenspiel von Schichtdicke, Fluoreszenzintensität und Zellzahl. Nehmen wir anhand der Abbildung an, dass N fluoreszierende Zellen gleichmäßig in einem homogenen Gewebevolumen mit einer Gesamttiefe von S µm verteilt sind. Jede Zelle ist nicht überlappend in einer festen Gewebetiefe mit einem Intervall von t µm eingebettet, wobei t = S/N. Jede Zelle weist eine Fluoreszenz unter der Oberfläche auf, die sich über mehrere Schichten mit einer Länge von e µm erstrecken kann. Bei der Kryo-Bildgebung wird das Gewebevolumen abwechselnd geschnitten und abgebildet, mit einer Schnittdicke von X µm. Der Vorgang wird wiederholt, bis die gesamte Probe aufgebraucht ist. Am Ende des Prozesses werden etwa S/X-Fluoreszenzbilder erzeugt. Um die Anzahl der Zellen im erfassten Volumen zu zählen, wird der CCA-Algorithmus (Connected Component Analysis) angewendet, um eine mehrfache Zählung derselben Zelle aufgrund von Fluoreszenz unter der Oberfläche zu verhindern.

Darstellung der Auswirkung unterschiedlicher Schnittdicken auf die Zellzahl. In diesem Beispiel wird davon ausgegangen, dass sich 7 nicht überlappende Zellen (gelbe Ovale) in jedem festen Tiefenintervall eines Gewebevolumens (grünes Kästchen) befinden. In diesem Beispiel beträgt das Tiefenintervall (t) 10 µm. Wir gehen weiterhin davon aus, dass sich das Zellsignal als Untergrundfluoreszenz höchstens 10 µm bis zur darüber liegenden Schicht erstrecken kann, bevor sein Signal nicht mehr nachweisbar ist (rote Tröpfchen). Somit beträgt die Fluoreszenztiefe (e) unter der Oberfläche 20 µm. Indem dieses Volumen durch die Fluoreszenzsignale unter der Oberfläche geschnitten wird, werden die entsprechenden Zellen in den ausgegebenen Bildschnitten als erkannt markiert. Mehrere Erkennungen derselben Zelle können mithilfe des CCA-Algorithmus zu einer Gruppe zusammengefasst werden. Daher kann man durch Schneiden des Volumens mit einer Schnittdicke (X) von 20 µm oder weniger alle Zellen im Gewebe auflösen. Durch das Schneiden mit größeren Schnittdicken, wie z. B. X = 30, 40 und 70 µm (oben rechts), werden die Zellen übersehen, was zu einer verringerten Nachweisempfindlichkeit führt.

Durch Schneiden und Abbilden des Volumens können die Zellsignale sowie die Fluoreszenzsignale unter der Oberfläche verwendet werden, um die Anzahl der Zellen im Volumen aufzulösen. Abbildung 3 zeigt die Situation, in der S = 70 µm, N = 7 Zellen, t = 10 µm und e = 20 µm. Mit X = 20 µm können alle Zellen im Gewebe korrekt aufgelöst und quantifiziert werden. Obwohl der Abstand zwischen benachbarten Zellen (t = 10 µm) geringer ist als die Schichtdicke (X = 20 µm), kann die unterirdische Fluoreszenz der übersprungenen Zelle immer noch im Ausgabebild erscheinen. Unter der Annahme, dass sich die Signale der benachbarten Zellen entlang der Z-Achse nicht überlappen, kann immer die wahre Anzahl der Zellen aufgelöst werden. Im Falle einer Überabtastung oder der Verwendung von X < 20 µm können Signale von derselben Zelle mehrfach erfasst werden, aber mit Hilfe von CCA kann die Anzahl der Zellen korrekt aufgelöst werden. Aber im Bereich einer zu geringen Probenahme oder wenn X > 20 µm ist, ist die Anzahl der erkannten Zellen geringer als die tatsächliche Anzahl der Zellen im Gewebe, wie in Abb. 3 dargestellt. Diese Situation führt zu falsch negativen Ergebnissen. Als nächstes werden wir ein mathematisches Modell der Beziehung zwischen der Erkennbarkeit fluoreszierender Zellen und der Schichtdicke vorschlagen, insbesondere im suboptimalen Bereich (X > Xoptimal).

Im suboptimalen Bereich (X > Xoptimal) nimmt die Anzahl der erkannten Zellen mit zunehmender Schichtdicke ab. Durch die Formulierung der mathematischen Beziehung kann man den Zellverlust vorhersagen und sogar einen Korrekturfaktor schätzen, um die Unterabtastung auszugleichen. In diesem Abschnitt wollen wir die Beziehung mit einigen Vereinfachungen konstruieren.

Denken Sie daran, dass Fluoreszenzsignale derselben Zelle in mehreren Schnitten als Untergrundfluoreszenz beobachtet werden können (Abb. 3 und 5). Die Out-of-Plane-Fluoreszenz führt zu einer unterirdischen Trübung in 2D-Bildern und zu einem Dehnungsartefakt entlang der Z-Achse, das in 3D als „Kometenschweif“ erscheint7,30,34. Die Länge des Signals einer einzelnen fluoreszierenden Zelle wird durch die Gleichungen bestimmt. (2) und (3). Wenn das Bildgebungssystem einen Teil der Untergrundfluoreszenz durchschneidet, sollte das Zellsignal im Ausgabebild erscheinen. Daher ist diese Fluoreszenzlänge (e) unter der Oberfläche tatsächlich die optimale Scheibendicke (Xoptimal), wie zuvor dargestellt. Unter Berücksichtigung von X > ein gegebenes Stück. Die Verteilung der Zellen hängt daher auch von der Wahrscheinlichkeit ab, dass sich eine Zelle in einer bestimmten Entfernung p(x) befindet. Dies lässt sich wie folgt formulieren:

Beachten Sie, dass die Wahrscheinlichkeitsverteilung p(x) für die Schichtdicke X aus der Verteilung di(x) innerhalb jeder dieser Schichten bestimmt wird. Wenn wir bedenken, dass es unterschiedliche Verteilungen über die Slices hinweg geben könnte, dann würde der Durchschnitt p(x) wie folgt bestimmt werden.

Dabei ist M die Anzahl der Slices, i der Slice-Index und wi = Ni/N.

Die Nachweisempfindlichkeit (Sens) wird durch das Verhältnis von n/N angegeben, das nur von der Wahrscheinlichkeitsverteilung fluoreszierender Zellen abhängt.

Unter der Annahme einer einheitlichen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, die zufällig verteilten Zellen in einem großen Gewebebereich entsprechen würde, lässt sich die Empfindlichkeit wie folgt formulieren:

Somit ist die Empfindlichkeit linear proportional zum Kehrwert von X und der Länge der Untergrundfluoreszenz (e):

Nimmt man den Logarithmus auf beiden Seiten und ersetzt e durch

Denken Sie daran, dass jenseits der optimalen Schichtdicke (X > Xoptimal) die Erkennungsempfindlichkeit mit zunehmender Schichtdicke abnimmt. Denken Sie außerdem daran, dass für alle X-Werte, die kleiner oder gleich Xoptimal sind, der Sens-Wert 100 % beträgt. Durch die Kombination von X-Werten aus dem idealen Bereich (X ≤ Xoptimal) und dem suboptimalen Bereich (X > Xoptimal) erhalten wir:

Beziehungen abgeleitet in Gl. (14) kann verwendet werden, um die fehlenden fluoreszierenden Zellen in den Bilddaten abzuschätzen, wenn man eine Kryo-Bildgebung mit einer Schichtdicke durchführt, die größer als der optimale Wert ist. Per Definition der Empfindlichkeit kann die wahre Anzahl der Zellen, Count(Xoptimal), geschätzt werden, indem die Anzahl der beobachteten Zellen im Volumen, Count(X), durch die Empfindlichkeit Sens(X) dividiert wird:

Zu diesem Zweck wird die bisherige Beziehung unter folgenden Grundannahmen hergestellt:

Alle Zellen sind in ein homogenes Gewebe eingebettet: Varianz(μT) ≈ 0.

Die Zellen im Gewebe haben die gleiche Intensität: Varianz(Ifluo) ≈ 0.

Die Zellen sind regional gut im Gewebe verteilt und überlappen sich nicht.

Für den Fall, dass es eine Verteilung D(Ifluo) gibt, die sich auf die N-Zellen bezieht, ist die Gesamtempfindlichkeit wie folgt gegeben:

was, wenn man berücksichtigt, dass die Zellen höchstens K unterschiedliche Intensitätswerte haben, zu einer diskretisierten Summation vereinfacht werden kann

Dabei ist j ein Index, der dem Einzelintensitäts-Ifluo entspricht, j zu Nj Zellen gehört und K die Anzahl der eindeutigen Ifluo-Werte ist. Beachten Sie, dass Xoptimal nur für Werte von Ifluo ≥ T nicht negativ ist, aber Sens(Ifluo) = 0 für alle Ifluo-Werte unter T. In einem Fall, in dem Zellen Ifluo < T haben, werden diese Zellen unabhängig von der Schichtdicke nicht erkannt. Daher muss die Anregungsintensität I0 erhöht oder andere Komponenten entlang der Fluoreszenzbildgebungskette über den Rahmen dieser Arbeit hinaus verbessert werden.

Als nächstes werden wir zeigen, dass die obigen Gleichungen mit realen Daten übereinstimmen, indem wir In-silico-Experimente durchführen und die Ergebnisse mit realen Daten vergleichen. Später werden wir weitere In-silico-Experimente in Situationen diskutieren, in denen die Schlüsselannahmen nicht erfüllt sind.

Wir haben digitale Schnittsimulationen programmgesteuert implementiert, um die Beziehung in den Gleichungen zu validieren. (13)–(14). Diese In-silico-Experimente basierten auf dem in den Abbildungen dargestellten Modell. 1, 2, 3, um die zuvor abgeleitete Beziehung zwischen Schichtdicke und Erkennungsempfindlichkeit zu validieren. Der digitale Schnittsimulationsalgorithmus lässt sich wie folgt zusammenfassen: (1) Erstellen Sie ein virtuelles homogenes Volumen der gesamten Probe (Dicke = S μm) und einen effektiven Dämpfungskoeffizienten (μT, cm−1), (2) Verteilen Sie Modellzellen alle 1 μm des Volumens. Da es eine Zelle pro 1 μm Tiefe gibt, gibt es im gesamten Volumen N = S Zellen. Jede Zelle hat eine Graustufenintensität von Ifluo, (3) Für jede Zelle im Volumen messen wir I(x) an der Oberfläche der Blockfläche, wobei x die Tiefe der Zelle relativ zur Blockfläche ist. Der Wert von I(x) wird durch eine maßgebliche Gleichung in Gl. bestimmt. (2), (4) Wenn I(x) größer oder gleich der Erkennungsschwelle T ist, wird die Testzelle als erkannt markiert [Gl. (3)]. (5) Schneiden Sie die oberste Schicht des Volumens um X μm ab. (6) Wiederholen Sie die Schritte (3)–(5), bis das gesamte Probenvolumen vollständig entfernt ist. (7) Geben Sie die Anzahl der erkannten Zellen aus. Einzelheiten zum Algorithmus sind in Pseudocode 1 beschrieben.

Mit dem Algorithmus haben wir zwei In-silico-Experimente mit Parameterwerten im Bereich durchgeführt, der typischerweise bei Kryo-Bildgebungsanwendungen beobachtet wird. Für das erste Experiment variierten wir die Schnittdicke und maßen die entsprechende Empfindlichkeit: Sens = n/N = TP/(TP + FN), wobei TP, FP und FN richtig positive, falsch positive bzw. falsch negative Werte sind. Wir gehen davon aus, dass die Schnittdicke der Probe, die dicker als die optimale Schnittdicke ist (X > Xoptimal), die Empfindlichkeit negativ beeinflussen würde. Für diese Simulation wurden drei Zellintensitäten ausgewählt: Ifluo = 30, 50 und 80 (Graustufenintensität). Die Zahlen wurden aus der Intensitätsverteilung von Zellen ausgewählt, die aus unserer Datenbank zur Stammzellbildgebung stammen. Die Parameter T und μT wurden auf 10 (Graustufe) bzw. 314 cm−1 eingestellt. Der Erkennungsschwellenwert (T) wurde empirisch basierend auf dem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in unseren Bilddaten geschätzt. Der Wert von μT wurde aus Mausgeweben in unserer Datenbank mithilfe einer von Steyer et al.34 vorgeschlagenen exponentiellen Anpassungsmethode geschätzt. Die in dieser Studie verwendete Programmierplattform war Matlab 2022a (MathWorks, USA).

Im zweiten Experiment haben wir die Schichtdicke festgelegt, aber die Zellintensität variiert und die entsprechende Empfindlichkeit gemessen. Durch die Festlegung der Schichtdicke (X = 20 μm) gehen wir davon aus, dass Zellen mit einer Intensität unterhalb der optimalen Intensität (Ifluo < Ioptimal) zu einer geringeren Nachweisempfindlichkeit führen könnten. Es wurden drei verschiedene Gewebeschwächungskoeffizienten ausgewählt, μT = 214, 314 und 414 cm−1, mit einem Inkrement von 100 cm−1. Diese Werte stimmten mit der Literatur überein33,34. Weitere verwendete Parameter waren T = 10 und X = 20 μm. Ziel dieses Experiments war es, die Auswirkung unterschiedlicher Gewebeabschwächungen auf die Nachweisempfindlichkeit zu zeigen.

Um die Gültigkeit unseres Modells weiter zu testen, verglichen wir die simulierten Ergebnisse mit realen Daten. Wir haben die Schnitt-und-Bild-Operation an den realen Daten durchgeführt, um dickere Schnitte zu erzeugen. Diese neuen Schnitte wurden aus dünn geschnittenen echten Bildern erstellt, die fluoreszierende Zellen enthielten. In dieser Studie verwendeten wir zwei Datensätze: (1) fluoreszierend markierte Stammzellen in einem Mausmodell2,9,11,12 und (2) fluoreszierende Mikrokügelchen in einem Schweinemodell5,26. Einzelheiten zu den Tierversuchen sind im Ergänzungsdokument beschrieben. Alle Tierversuche wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Sie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Case Western Reserve University genehmigt. Wir bestätigen außerdem, dass die Studie gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet wird. Als Nächstes beschreiben wir Schritte zur Simulation dicker Abschnitte aus dünn geschnittenen realen Daten, um die Auswirkung der Schichtdicke auf die Erkennungsempfindlichkeit zu bestimmen. Wir gehen davon aus, dass die von der Theorie vorhergesagten Ergebnisse [Gl. (13)–(14)] sollten mit realen Daten korrelieren.

Im ersten Datensatz haben wir den Stammzellendatensatz zur Simulation verwendet. Ein Rohbild, das auf die fluoreszierenden Zellsignale gezoomt wird, ist in Suppl dargestellt. Abb. 1A. Die Bilder wurden dann gestapelt, registriert und in 3D in Abb. 4B visualisiert. Um Schnitt- und Bildsimulationen durchzuführen, haben wir ein neues Volumen mit dickeren Schichtdaten erstellt, indem wir Bilder aus dem Originalvolumen ausgewählt haben, aber alle zwei Schichten übersprungen haben. Da die Schnittdicke ursprünglich auf 20 μm eingestellt war, hätte das neue Volumen, das aus der Hälfte der Originalbilder bestand, eine Schichtdicke von 40 μm. Um Volumina mit unterschiedlichen Schichtdicken zu erhalten, wiederholten wir das Experiment, indem wir alle 3, 4, 5 …, 50 Schichten übersprangen, um einer Kryo-Bildgebung mit Schichtdicken von 60, 80, 100, …, 300 μm zu ähneln. Für jedes Volumen wurde die Anzahl der Stammzellen mithilfe des zuvor veröffentlichten Algorithmus, der 3D-CCA10 umfasst, erfasst und quantifiziert. Wir fassen den Prozess in Pseudocode 2 zusammen. Um die Ergebnisse mit unserem Modell zu vergleichen, führten wir eine In-silico-Simulation (Pseudocode 1) mit aus den realen Daten geschätzten Parametern durch. Kurz gesagt, ich wurde anhand der mittleren Intensität der erkannten Zellen geschätzt. T wurde heuristisch geschätzt, indem die Zahl der Zelldetektionen optimiert und gleichzeitig die Fehlalarme minimiert wurden, und schließlich wurde μT mithilfe einer von Steyer et al.34 vorgeschlagenen exponentiellen Regressionsmethode geschätzt. Um die Gültigkeit der Simulation zu testen, führten wir einen Korrelationstest der Simulationsergebnisse mit den Ergebnissen realer Daten durch. Als Metriken verwendeten wir den Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten und den quadratischen Mittelwertfehler (RMS-Fehler).

Kryo-Bildgebung ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung von Stammzellen überall in Mäusen mit sehr hoher Erholungsrate. Einer Maus wurden 5 × 105 Stammzellen intravenös injiziert. Ungefähr 290.000 Zellen wurden erkannt und sichtbar gemacht (gelbe Perlen in A). Die Wiederfindungsrate (Anzahl detektierter Zellen/Lieferung) betrug 58 %. In einem anderen Experiment wurden 1 × 105 Stammzellen direkt in einen Lungenlappen einer Maus injiziert. Es wurden etwa 94.269 Zellen nachgewiesen (magentafarbene Kügelchen in B). Dies ergab eine Wiederherstellungsrate von 94 %.

Im zweiten Datensatz verwendeten wir Bilder eines Schweineherzens, das fluoreszierende Mikrokügelchen enthielt, um die Simulation durchzuführen. Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen wurden rote und grüne Mikrokügelchen in den rechten Ventrikel des Schweins injiziert (siehe Zusatzdokument). Da das Schweineherz recht groß war, verwendeten wir nur einen kleinen Teil des Gewebes. Die Schnittdicke wurde auf 10 µm eingestellt. Da rote Mikrokügelchen und grüne Mikrokügelchen unter unserem Standardbildfilter 1,2,5,9 unterschiedliche Helligkeiten aufwiesen, haben wir sie getrennt verarbeitet. Die roten Mikrokügelchen waren von viel hellerer Intensität als die grünen Mikrokügelchen. Beispiele für die fluoreszierenden Mikrosphärensignale und die 3D-Visualisierung sind in Suppl dargestellt. Abb. 1B bzw. Abb. 5. Wir haben die Schnitt- und Bildsimulation durchgeführt, um neue Volumina zu erstellen, und zwar nach dem gleichen Verfahren wie bei Stammzelldaten. Die Parameter Ifluo, T und μT für die Mikrokügelchen wurden ebenfalls mit der gleichen zuvor beschriebenen Methode geschätzt. Auch hier wurden die In-silico-Ergebnisse mit realen Daten verglichen.

Rote und grüne Mikrokügelchen in den Kryo-Bildgebungsdaten des Schweinemyokards. Rote Mikrokügelchen wurden während einer Ausgangssituation in den linken Ventrikel eines Schweins injiziert, während grüne Mikrokügelchen während einer induzierten Ischämie an derselben Stelle injiziert wurden. Die Abbildungen (A) (Herauszoomen) und (B) (Heranzoomen) zeigen Volumendarstellungen der Mikrokügelchen, die im Myokardgewebe aus einem Spitzensegment des Herzens eingeschlossen sind. Die Fluoreszenzsignale waren gemäß den Emissionsspektren der Mikrokügelchen (rot und grün) falsch gefärbt. Beachten Sie, dass die roten Mikrokügelchen in unserem Bildgebungssystem heller waren als die grünen Mikrokügelchen. Abbildung (C) zeigt die Fluoreszenz unter der Oberfläche einer roten Mikrosphäre, die sich mehrere Scheiben über die Scheibe erstreckt, die die Mikrokugel enthält (Scheibe 15). Sobald die Schicht geschnitten wurde, verschwand das Signal (Schicht 16). In diesem Beispiel lag die Intensität in den Schichten jenseits von „Schicht 10“ unter der Erkennbarkeitsschwelle. Die Scheibendicke betrug 10 µm.

Um die Auswirkungen von Nichteinhaltungen der Schlüsselannahmen für die Erkennbarkeit zu zeigen, haben wir drei zusätzliche In-silico-Simulationen durchgeführt. Die Simulationen zielen darauf ab, die Auswirkungen von (1) Gewebeinhomogenität, (2) Zellhelligkeitsschwankungen und (3) Zellsignalüberlappung auf die Erkennbarkeit zu untersuchen, wie sie in den Empfindlichkeits-Dicken-Kurven beobachtet werden. In der ersten Simulation wurden die Modellzellen überlappungsfrei in einem virtuellen Gewebe platziert. Alle Zellen hatten die gleiche Helligkeit (Ifluo = 40), wiesen jedoch unterschiedliche Gewebeschwächungen µT auf, um Situationen zu simulieren, in denen das interessierende Gewebe eine Mischung aus verschiedenen Gewebetypen ist (inhomogenes Gewebe). Es wurden vier Variabilitätsstufen getestet: (1) µT = 314 cm−1 (keine Variation), (2) µT = 314 ± N(σ ~ 50) cm−1, (3) µT = 314 ± N(σ ~ 100). ) cm−1 und (4) µT = 314 ± N(σ ~ 150) cm−1, wobei N(σ) einen normalen Zufallszahlengenerator mit einem Mittelwert von Null und einer Standardabweichung von σ darstellt. Der digitale Schnitt wurde durchgeführt, um die Empfindlichkeit gegenüber der Schichtdicke gemäß Pseudocode 1 zu messen.

In der zweiten Simulation wurden die Modellzellen in einem virtuell homogenen Gewebe platziert, jedoch mit Variationen der Zellhelligkeit. Es wurden vier Variabilitätsstufen getestet: (1) Ifluo = 40 (keine Variation), (2) Ifluo = 40 ± N(σ ~ 5) cm−1, (3) Ifluo = 40 ± N(σ ~ 10) cm− 1 und (4) Ifluo = 40 ± N(σ ~ 15) cm−1. Der effektive Gewebeschwächungskoeffizient µT wurde auf 314 cm−1 festgelegt. Die Variabilität kann Situationen wie den Verlust fluoreszierender Farbstoffe durch Zellen, abgestorbene Zellen, sich teilende Zellen, Photobleichung, schlechte Markierung usw. darstellen. Anschließend haben wir die digitalen Schnitte an diesen Simulationen durchgeführt, um die Empfindlichkeits-Dicken-Kurve zu messen, wie im Pseudocode 1 beschrieben.

In der letzten Simulation haben wir die Auswirkung unterschiedlicher Zellüberlappungsgrade auf die Erkennbarkeit simuliert. Zellüberlappung ist definiert als zwei verschiedene Zellen, die entlang der Tiefenachse nahe beieinander liegen, sodass ihre Fluoreszenzsignale unter der Oberfläche verschmelzen und als ein einziges Signal „gesehen“ werden können. Dies kann zu einer Verringerung der Nachweisempfindlichkeit führen, da zwei oder mehr Zellen nur als eine gezählt werden. Um den Effekt zu zeigen, wurde die Simulation durchgeführt, indem die Modellzellen zufällig auf einem festen Gewebebereich platziert wurden, um eine Überlappung der unterirdischen Fluoreszenzen mehrerer Zellen zu ermöglichen. Der Grad der Überlappung wird durch die Dichte bestimmt, die aus der Anzahl der Modellzellen pro Gewebefläche (in der Einheit Zellen/cm2) berechnet wird. Es wurden vier Grade der Zellüberlappung getestet: (1) Keine Überlappung, (2) Dichte = 400 Zellen/cm2, (3) Dichte = 800 Zellen/cm2 und (4) Dichte = 1600 Zellen/cm2. Die Werte von µT und Ifluo wurden auf 314 cm−1 bzw. 40 festgelegt. Die unterschiedlichen Grade der Zellüberlappung stellen Fälle wie Immunzellaggregation im lymphatischen/entzündeten Gewebe, Tumormassen, Lungenembolien usw. dar. Auch hier wurde die Empfindlichkeits-Dicken-Kurve gemessen und aufgezeichnet.

Kryo-Bildgebung ermöglichte die 3D-Visualisierung und Quantifizierung fluoreszierend markierter Zellen in einer Maus mit einer sehr hohen Wiederherstellungsrate. Wie im Zusatzdokument beschrieben, wurden der Maus 5 × 105 MAPCs intravenös injiziert. Nach der Ausführung des Stammzellerkennungsalgorithmus10 wurden etwa 290.000 Zellen erkannt und sichtbar gemacht (gelbe Perlen in Abb. 4A). In diesem Datensatz betrug die Wiederherstellungsrate (Anzahl erkannter Zellen/Lieferung) 58 %. In einem anderen Experiment wurden 1 × 105 FAC-sortierte MSCs direkt in einen Lungenlappen einer Maus injiziert. Nach Anwendung des Algorithmus wurden 94.269 Zellen erkannt (magentafarbene Perlen in Abb. 4B). Dies ergibt eine Wiederherstellungsrate von 94 %. Die Anzahl der Nachweise bei Mäusen, denen unmarkierte Zellen injiziert wurden (falsch positive Ergebnisse), war signifikant gering (p < 0,01, zweiseitiger Student-t-Test). Beispiele für Stammzellsignale finden Sie in Suppl. Abb. 1A.

Die In-silico-Simulationen zeigten die Beziehungen zwischen Schichtdicke und Nachweisempfindlichkeit. Wir haben zwei Simulationen durchgeführt – in der ersten haben wir digitale Schnitte mit unterschiedlichen Schichtdicken durchgeführt und die entsprechende Nachweisempfindlichkeit gemessen. Die Schichtdicke (X) lag zwischen 5 und 150 μm. Wir beobachteten, dass bei kleinen Werten der Schichtdicke die Empfindlichkeit bei 100 % blieb, bis der Wert einen bestimmten Punkt erreichte, an dem die Empfindlichkeit abzunehmen begann (Abb. 6). Dieser Punkt war tatsächlich die optimale Schichtdicke (Xoptimal) für die Kryo-Bildgebung. In dieser Simulation haben wir drei Intensitätswerte untersucht: Ifluo = 30, 50 und 80 (Graustufe). Die Parameter T und μT wurden auf 10 (Graustufe) bzw. 314 cm−1 eingestellt. Wir haben die Simulationen in Abb. 7 dargestellt, um zu zeigen, wie die Signale der Modellzelle und ihre Erkennbarkeit im virtuellen Volumen aussehen. Beachten Sie, dass die Zellen gemäß der Annahme einer Nichtüberlappung im Gewebe platziert wurden. Als Ergebnis stellten wir fest, dass Xoptimal für die Simulationen mit Ifluo = 30, 50 und 80 35 μm, 51 μm bzw. 66 μm betrug. Die Ergebnisse stimmten mit der durch Gleichung geschätzten optimalen Schnittdicke überein. (5). Wir beobachteten, dass bei niedrigeren Fluoreszenzintensitätsniveaus (Ifluo) die Empfindlichkeit schneller abnahm (verschiedene Marker in Abb. 6A). Im suboptimalen Bereich (X > Xoptimal) erschien die Kurve als die in Gl. abgeleitete Kehrfunktion. (14). Durch die Darstellung der Beziehung auf einer Log-Log-Skala wird gezeigt, dass die Beziehung vollkommen linear ist (Abb. 6B), wie durch die mathematische Ableitung vorhergesagt, die im Abschnitt „In-silico-Simulationen für nicht konforme Situationen“ beschrieben wird.

Die durch die Simulation geschätzte Beziehung zwischen Schnittdicke und Nachweisempfindlichkeit stimmte mit der Theorie überein. Das Simulationsergebnis in (A) zeigt die optimale Schichtdicke (Xoptimal), also die größte Schichtdicke, die eine Erkennungsempfindlichkeit von 100 % ergibt. Durch das Schneiden des Volumens mit einer Schnittdicke, die größer als dieser Wert ist (rechts im Diagramm), verringerte sich die Empfindlichkeit erheblich. In dieser Simulation haben wir drei Zellintensitätsstufen simuliert: Ifluo = 30, 50 und 80 (Graustufe). Wir beobachteten, dass der Wert der Schichtdicke umso höher war, je heller die fluoreszierenden Zellen waren. Dies stimmte mit unserer Ableitung in Gl. überein. (14). Als wir die Beziehung in einer Log-Log-Skala (B) darstellten, zeigte das Diagramm interessanterweise perfekte Linearität über den suboptimalen Bereich (X > Xoptimal).

Veranschaulichung des Einflusses unterschiedlicher Zellintensitäten auf die Nachweisbarkeit. Wir haben Situationen mit 3 Zellintensitäten simuliert: Ifluo = 30 in (A), 50 in (B) und 80 in (C). In den Simulationen haben wir synthetische Zellen überlappungsfrei in einem virtuellen Volumen platziert. Jede Zelle dehnte ihre Fluoreszenz unter der Oberfläche nach oben aus, wie in Gl. (2). Die Visualisierung der Erkennbarkeit der Zellen in (A–C) wurde jeweils in (D–F) gezeigt. Diese wurden durch Binärisierung der Zellsignale in (A–C) unter Verwendung von Gl. durchgeführt. (3). Die Ergebnisse zeigen, dass die Erkennbarkeit der Zelle (die Fluoreszenzlänge unter der Oberfläche) linear proportional zur Zellintensität ist.

Für die zweite Simulation untersuchten wir die Auswirkung der Zellintensitätsniveaus auf die Nachweisempfindlichkeit (Abb. 8). In dieser Simulation haben wir die Schnittdicke festgelegt (X = 20 μm), aber die Zellintensität im Bereich von 1 bis 30 (Graustufe) variiert. Wir wiederholten die Simulation auch mit verschiedenen Gewebeschwächungskoeffizienten (μT), die 214, 314 und 414 cm−1 betrugen (Schritte von 100 cm−1). Das Ergebnis in Abb. 8 zeigt, dass die Empfindlichkeit bei 100 % gehalten werden konnte, wenn die Zellintensität größer als die in Gleichung vorhergesagte optimale Intensität war. (6). Wir fanden heraus, dass für μT = 214, 314 und 414 (cm-1) die geschätzten Werte von Ioptimal 15,34, 18,74 bzw. 22,89 (Graustufe) betrugen. Das Ergebnis zeigt, dass je höher die μT-Werte waren, desto höher war die Zellhelligkeit, die zur Aufrechterhaltung einer 100-prozentigen Empfindlichkeit erforderlich war. Wie erwartet führten Zellen mit einer Intensität unterhalb der Nachweisschwelle (T = 10) zu einem Verlust von 100 % (0 % Empfindlichkeit). Wir haben auch die Simulationen in Abb. 9 dargestellt, um zu zeigen, wie die Signale der Modellzelle und ihre Erkennbarkeit im virtuellen Volumen aussehen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zelldetektierbarkeit (die Fluoreszenzlänge unter der Oberfläche) umgekehrt mit dem Gewebeschwächungskoeffizienten korreliert, wie in Gleichung (1) beschrieben. (5).

Auch der durch die Simulation geschätzte Zusammenhang zwischen Zellintensität und Nachweisempfindlichkeit stimmte mit der Theorie überein. In dieser In-silico-Simulation wurde die Nachweisempfindlichkeit für jede Änderung der Zellhelligkeit aufgezeichnet. Das Ergebnis legt nahe, dass die Zellintensität mindestens der optimalen Zellintensität entsprechen muss, wie in Gl. vorhergesagt, um eine Nachweisempfindlichkeit von 100 % aufrechtzuerhalten. (6). Wenn andererseits die Intensität kleiner als dieser Wert ist (links von der x-Achse), nimmt die Empfindlichkeit deutlich ab. Durch die Erhöhung des Gewebeschwächungskoeffizienten (μT) wäre eine höhere Zellintensität erforderlich, um eine 100-prozentige Nachweisempfindlichkeit (verschiedene Marker) aufrechtzuerhalten.

Darstellung der Auswirkung unterschiedlicher Gewebeschwächungskoeffizienten auf die Nachweisbarkeit. Wir haben Situationen mit 3 Gewebeschwächungskoeffizienten simuliert: µT = 214 cm−1 in (A), 314 cm−1 in (B) und 414 cm−1 in (C). Die Visualisierung der Erkennbarkeit der Zellen in (A–C) wurde jeweils in (D–F) gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zelldetektierbarkeit (die Fluoreszenzlänge unter der Oberfläche) umgekehrt mit dem Gewebeschwächungskoeffizienten korreliert, wie in Gleichung (1) beschrieben. (5).

Als nächstes diskutieren wir die Korrelation zwischen unseren Simulationen und realen Daten. Für die Myokardgewebedaten von Schweinen fanden wir etwa 4600 fluoreszierende Mikrokügelchen (rot und grün) im interessierenden Volumen (Abb. 5). Wir haben eine Schnitt- und Bildsimulation mit unterschiedlichen Schichtdicken im Bereich von 10 bis 300 μm durchgeführt. Nach Durchführung der Mikrosphärenquantifizierung ist die Anzahl der roten und grünen Mikrosphären in Abb. 10A bzw. B dargestellt. Wie erwartet konnten bei kleinen Werten der Schichtdicke (links im Diagramm) alle Mikrokügelchen im Gewebevolumen korrekt aufgelöst werden. Durch Erhöhen des Schichtdickenwerts (rechts im Diagramm) konnte die Empfindlichkeit nur so lange bei 100 % gehalten werden, bis der Wert einen bestimmten Punkt (Xoptimal) erreichte, an dem die falsch-negativen Ergebnisse zuzunehmen beginnen. Diese Beobachtung traf sowohl auf rote als auch auf grüne Mikrosphären-Datensätze zu. Wir führten unabhängig voneinander In-silico-Simulationen durch und erstellten die Beziehungen auf der Grundlage geschätzter Parameter. Es wurde festgestellt, dass die Parametersätze (Ifluo = 300, μT = 332 cm−1) für die Simulation der roten Mikrokügelchen und (Ifluo = 87, μT = 372 cm−1) für die Simulation der grünen Mikrokügelchen waren. Die Ergebnisse in Abb. 10 zeigen, dass die Beziehung zwischen Schichtdicke und Erkennbarkeit aus der Simulation nahezu den realen Daten entsprach. Die Korrelationskoeffizienten zwischen den beiden Beziehungen betrugen 0,998 und 0,999 für die roten bzw. grünen Mikrokügelchen. Nach der Erkennung und Quantifizierung der Mikrokügelchen enthielt der Datensatz etwa 2000 rote Mikrokügelchen und 2600 grüne Mikrokügelchen. Die gemessenen RMS-Fehler betrugen 36,54 (1,82 %) und 42,87 (1,65 %) für die roten bzw. grünen Mikrokügelchen. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die geschätzten Werte von Xoptimal 102,45 μm für die roten Mikrokügelchen und 58,15 μm für die grünen Mikrokügelchen betrugen. Diese Werte geben die beste Schnittdicke an, die eine ideale Mikrosphärenerkennung mit der minimalen Anzahl von Schnitten gewährleistet. Wir beobachteten, dass die roten Mikrokügelchen in den Rohdaten etwa dreimal heller waren als die grünen Mikrokügelchen (Suppl. Abb. 1B und Abb. 5). Das Ergebnis war, dass die roten Mikrokügelchen im Vergleich zu den grünen Mikrokügelchen eine größere Schnittdicke ermöglichten (Abb. 10A, B). Dies stimmte mit unserer Ableitung in Gl. überein. (5). Auch hier zeigen die Ergebnisse durch die Darstellung der Beziehungen auf einer Log-Log-Skala nahezu perfekte lineare Beziehungen im suboptimalen Bereich (X > Xoptimal) (Abb. 10C, D).

Die aus realen Daten ermittelte Beziehung zwischen der Erkennbarkeit von Mikrokügelchen und der Schichtdicke korrelierte stark mit der aus den Simulationen. In diesem Experiment wurde das Gewebevolumen, das etwa 4600 fluoreszierende Mikrokügelchen enthielt, mit unterschiedlichen Schnittdicken (von 10 bis 300 µm) geschnitten. Die Anzahl der Mikrosphärenerkennungen für jede Schichtdicke wird für rote Mikrosphären in (A) und für grüne Mikrosphären in (B) angezeigt (schwarze Linie mit Dreiecksmarkierungen). Mit sorgfältig ausgewählten Parametern konnte unsere Simulation die Beziehungen vorhersagen, die vollständig mit den realen Daten übereinstimmten (graue Linie mit quadratischen Markierungen). Wenn wir die Beziehungen auf einer Log-Log-Skala (C–D) darstellen, zeigen die Ergebnisse interessanterweise die perfekte lineare Beziehung zwischen der Anzahl der Erkennungen und der Schichtdicke. Dies könnte verwendet werden, um die tatsächliche Anzahl der Zellen in den Daten abzuschätzen, insbesondere wenn die gewählte Schichtdicke größer als optimal ist.

Die aus dem Stammzelldatensatz erhaltene Beziehung stimmte auch mit der Simulation überein. In diesem Datensatz wurden etwa 1 × 105 fluoreszierend markierte Stammzellen direkt in einen Lungenlappen der Maus injiziert. Simulierte Schnitt- und Bildanalysen sowie Zelldetektion wurden wiederholt am Gewebevolumen mit unterschiedlichen Schnittdicken im Bereich von 10 bis 300 μm durchgeführt. Die Ergebnisse in Abb. 11 zeigen, dass die Beziehung „Zellerkennung vs. Schichtdicke“ mit der Theorie übereinstimmt. Die aus der Simulation erhaltene Beziehung stimmte auch gut mit realen Daten überein. Der Korrelationskoeffizient betrug 0,999 und der RMS-Fehler betrug 1601 Zellen (oder 1,6 % der injizierten Zellen). Die Ergebnisse in Abb. 11 deuten darauf hin, dass das Xoptimal bei etwa 40 μm lag, während das Modell einen Xoptimalwert von 42,52 μm vorhersagte. Die geschätzten Parameter waren T = 10, Ifluo = 38 und μT = 314 cm−1 für die mit roten Quantenpunkten markierten Stammzellen. Wir beobachten, dass der Bereich der Xoptimal-Werte für die Zellen viel enger war als der der fluoreszierenden Mikrokügelchen (~ 40 μm gegenüber ~ 60–100 μm). Dies lag daran, dass die Zellhelligkeit (~ 40) viel geringer war als die der Mikrokügelchen (~ 80–400).

Die aus realen Daten erhaltene Beziehung zwischen Zellnachweisbarkeit und Schichtdicke korrelierte ebenfalls stark mit der aus den Simulationen. In diesem Experiment wurden einer Mauslunge 1 × 105 fluoreszenzmarkierte Stammzellen injiziert. Das Gewebevolumen wurde mit unterschiedlichen Schichtdicken (von 20 bis 300 μm) geschnitten. Die Anzahl der Zellerkennungen für jede Schichtdicke wird angegeben (A). Die Beziehung auf einer Log-Log-Skala ist auch in (B) dargestellt. Auch hier konnte die Simulation die Beziehung vorhersagen, da sie nahezu mit den realen Daten (schwarze Linie mit Dreiecksmarkierungen) überlappte (graue Linie mit quadratischen Markierungen). Der Korrelationskoeffizient zwischen realen und simulierten Daten betrug 0,999. Der Xoptimal-Wert lag bei etwa 40 μm, wobei das Modell einen Xoptimal-Wert von 42,52 μm vorhersagte.

Darüber hinaus haben wir drei In-silico-Experimente durchgeführt, um die Auswirkungen wichtiger Annahmen auf die Nachweisbarkeit zu zeigen. Zunächst wurde der Gewebeinhomogenitätseffekt getestet, indem den Modellzellen unterschiedliche µT-Werte zugewiesen wurden, um Situationen zu simulieren, in denen das interessierende Gewebe eine Mischung aus verschiedenen Gewebetypen ist. Abbildung 12 zeigt die Zellsignale und ihre erkennbaren Signale in drei virtuellen Geweben mit jeweils unterschiedlichen µT-Variabilitätsniveaus. Bitte beachten Sie, dass die Zellintensität und ihre Nachweisbarkeit in allen Ergebnissen durch die Gleichungen bestimmt wurden. (2) bzw. (3). Die entsprechenden Empfindlichkeits-Dicken-Kurven sind in Abb. 13 dargestellt. Im Vergleich zum homogenen Gewebe nahm die Empfindlichkeit im inhomogenen Gewebe früher ab als der optimale Punkt. Die optimalen Punkte in diesen Situationen sind nicht genau definiert und in der Empfindlichkeits-Dicken-Kurve schwer zu bestimmen. Wir beobachten auch, dass je höher die Variation ist, desto weniger steil ist die Empfindlichkeits-Dicken-Steigung (neigt sich zu 0°) in der Log-Log-Skala (Abb. 13B).

Veranschaulichung des Einflusses der Gewebeinhomogenität auf die Nachweisbarkeit. Die µT in den Simulationen (A–C) wurden auf 314 ± N(σ ~ 50) cm−1, 314 ± N(σ ~ 100) cm−1 bzw. 314 ± N(σ ~ 150) cm−1 eingestellt. N(σ) stellt einen normalen Zufallszahlengenerator mit einem Mittelwert von Null und einer Standardabweichung von σ dar. Die Visualisierung der Erkennbarkeit der Zellen in (A–C) wurde jeweils in (D–F) gezeigt. Der höhere Wert von σ spiegelt den höheren Grad der Inhomogenität im Gewebeschwächungskoeffizienten wider.

Der Einfluss der Gewebeinhomogenität auf die Nachweisempfindlichkeit. Ohne Abweichungen wie bei einem homogenen Gewebe [schwarze Linie in (A)] beginnt die Erkennungsempfindlichkeit genau am Punkt der optimalen Schichtdicke abzunehmen. Bei Variationen, beispielsweise bei inhomogenen Geweben, nahm die Empfindlichkeit viel früher als am optimalen Punkt ab. Je höher die Variation ist, desto weniger steil ist die Sensitivitäts-Dicken-Steigung (neigt sich zu 0°) in der Log-Log-Skala (B).

Zweitens wurde der Effekt der Zellhelligkeitsvariation getestet, indem den Modellzellen unterschiedliche Ifluo-Werte zugewiesen wurden. Abbildung 14 zeigt die Zellsignale und ihre nachweisbaren Signale in drei virtuellen Geweben mit jeweils unterschiedlichen Graden der Ifluo-Variabilität. Die entsprechenden Empfindlichkeits-Dicken-Kurven sind in Abb. 15 dargestellt. Im Vergleich zum Fall einer stabilen Zellhelligkeit nahm die Empfindlichkeit viel früher als am optimalen Punkt ab. Auch hier sind die optimalen Punkte nicht genau definiert und in der Empfindlichkeits-Dicken-Kurve schwer zu bestimmen. Darüber hinaus beobachten wir, dass alle Empfindlichkeits-Dicken-Kurven bei –45° in der Log-Log-Skala die gleiche Steigung beibehalten (Abb. 15B).

Darstellung der Auswirkung der Zellhelligkeitsschwankungen auf die Erkennbarkeit. Die Ifluo in Simulationen (A–C) wurden auf 40 ± N(σ ~ 5), 40 ± N(σ ~ 10) bzw. 40 ± N(σ ~ 15) eingestellt. N(σ) stellt einen normalen Zufallszahlengenerator mit einem Mittelwert von Null und einer Standardabweichung von σ dar. Der höhere Wert von σ spiegelt den höheren Grad der Inhomogenität der Zellhelligkeit wider. Die Visualisierung der Erkennbarkeit der Zellen in (A–C) wurde jeweils in (D–F) gezeigt.

Die Auswirkung von Zellhelligkeitsschwankungen auf die Erkennungsempfindlichkeit. Ohne Variation der Zellintensität (schwarze Linie in (A)) beginnt die Erkennungsempfindlichkeit genau am Punkt der optimalen Schichtdicke abzunehmen. Mit den Variationen nahm die Empfindlichkeit viel früher als am optimalen Punkt ab. Die optimalen Punkte in diesen Situationen sind nicht genau definiert und in der Empfindlichkeits-Dicken-Kurve schwer zu bestimmen. Wir beobachten auch, dass alle Empfindlichkeits-Dicken-Kurven bei –45° in der Log-Log-Skala (B) die gleiche Steigung beibehalten.

Zuletzt wurde der Zellüberlappungseffekt getestet, indem die Modellzellen zufällig in einem festen Bereich des virtuellen Gewebes platziert wurden, um Überlagerungen ihrer Fluoreszenz unter der Oberfläche zu ermöglichen. Der Grad der Überlappung wird durch die Dichte bestimmt, die aus der Anzahl der Modellzellen pro Gewebefläche berechnet wird. Abbildung 16 zeigt die Zellsignale und ihre erkennbaren Signale in drei virtuellen Geweben mit jeweils unterschiedlichen Dichtewerten. Einige der überlappenden Punkte in Abb. 16 haben wir mit gelben Pfeilspitzen gekennzeichnet. Die entsprechenden Empfindlichkeits-Dicken-Kurven sind in Abb. 17 dargestellt. Im Vergleich zum Fall ohne Überlappung nahmen die Empfindlichkeitskurven in den überlappenden Fällen vom Anfang (X = 1 µm) bis zum Erreichen des optimalen Punkts (bei X = 44) linear ab µm), wobei die Kurven begannen, hyperbolisch abzufallen. Interessanterweise waren die optimalen Punkte in allen Situationen gut definiert (X = 44 µm), aber die Empfindlichkeiten konnten an keinem Punkt mehr 100 % garantiert werden (außer X = 1 µm). Mit höherem Grad der Zellüberlappung (bestimmt durch die Dichte) nahm die Empfindlichkeitskurve schneller ab.

Veranschaulichung der Auswirkung der Zellüberlappung auf die Erkennbarkeit. Zwei beliebige Zellen können einander überlappen, wenn sie entlang der vertikalen Achse zu eng sind, sodass sie als ein Objekt „gesehen“ werden (gelbe Pfeilspitzen). Der überlappende Effekt führt immer zu falsch negativen Ergebnissen oder zum Fehlen von Zellen. Wir haben auch mit unterschiedlichen Zelldichten experimentiert, um die Zellüberlappungseffekte zu verstärken. In den Simulationen (A–C) wurden die Zelldichten auf 400, 800 bzw. 1600 Zellen/cm2 eingestellt. Die Visualisierung der Erkennbarkeit der Zellen in (A–C) wurde jeweils in (D–F) gezeigt.

Die Auswirkung der Zellüberlappung auf die Nachweisempfindlichkeit. Ohne Überlappung der Zellsignale (schwarze Linie) beginnt die Detektionsempfindlichkeit genau am Punkt der optimalen Schichtdicke abzunehmen. Mit der Überlappung nahm die Empfindlichkeit von Anfang an linear ab (X = 1 µm) bis zum Erreichen der optimalen Schichtdicke (X = 44 µm), wo die Empfindlichkeit hyperbolisch abzunehmen begann. Mit höherem Grad der Zellüberlappung (bestimmt durch die Dichte) nahm die Empfindlichkeit stärker ab. Obwohl die optimalen Punkte in allen Situationen gut definiert sind (bei X = 44 µm), konnte die perfekte Empfindlichkeit nicht in allen Situationen aufrechterhalten werden (Sens < 100 %).

Wir haben ein Modell erstellt, das zur Steuerung der Auswahl der Schichtdicke in Schnitt- und Bildsystemen für Anwendungen der Zellerkennung (z. B. Stammzellen und Mikrometastasen) und Mikrosphären geeignet ist. Das Modell beschreibt erstmals explizit Faktoren, die zur Erkennbarkeit fluoreszierender Zellen in der Kryo-Bildgebung beigetragen haben. Die Schlüsselfaktoren waren die Schnittdicke (X), die Fluoreszenzzellintensität (Ifluo), der effektive Gewebeschwächungskoeffizient (μT) und eine Erkennungsschwelle des Systems (T). Das Modell legt den Wert der optimalen Schichtdicke nahe [Xoptimal in Gl. (5)] Dies ist die größte Schichtdicke, die eine 100-prozentige Zellerkennung garantiert. Diese optimale Schnittdicke ermöglicht es dem Kryo-Bildgebungssystem nicht nur, alle fluoreszierenden Zellen in der Gewebeprobe zu erfassen und zu erkennen, sondern ermöglicht es Benutzern auch, den Bildgebungsprozess zu beschleunigen und die Lebensdauer des Schnittmessers und anderer mechanischer Teile zu verlängern . Das Modell wurde auf den Daten der Kryo-Bildgebungstechnik unter einigen Schlüsselannahmen aufgebaut. Wir spekulieren, dass das Modell auf andere Blockflächen-Bildgebungstechniken anwendbar sein könnte, wie z. B. die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM), die Mikroskopie mit UV-Oberflächenanregung (MUSE)-Bildgebung usw.

In dieser Arbeit haben wir erstmals den Zusammenhang zwischen der Schichtdicke (X) und der Nachweisempfindlichkeit (Sens) dargestellt. Diese Beziehung wurde unter der Grundannahme ermittelt, dass alle intensitätsstabilen Zellen gleichmäßig und ohne Überlappung in einem homogenen Gewebe verteilt waren. Mit diesen Annahmen könnten wir mathematische Modelle ableiten, die die Anzahl der Zellerkennungen vorhersagen, Gl. (11) und die Sens-Werte Gl. (13)–(14) für jede suboptimale Wahl der Schichtdicke (X > Xoptimal). Nachdem wir auf den Annahmen basierende In-silico-Simulationen durchgeführt hatten, machten wir die folgenden Beobachtungen. Wenn X ≤ Xoptimal, war der Sens-Wert konstant bei 100 %, aber wenn X > Xoptimal, nahm er als nichtlineare Funktion von X ab (Abb. 6A). Es wurde gezeigt, dass die Beziehung im suboptimalen Bereich eine reziproke Funktion von X Gl. ist. (14). Bei der Darstellung auf einer Log-Log-Skala war die Beziehung linear mit einer Steigung von -1 (Abb. 6B). Wir spekulieren, dass dieser Zusammenhang für reale Daten gelten würde, wenn sich die fluoreszierenden Zellen auf eine Weise verhalten würden, die mit unseren Grundannahmen übereinstimmt. Bitte beachten Sie, dass wir auch ein probabilistisches Modell entwickelt haben, um das Empfindlichkeitsprofil in Fällen vorherzusagen, in denen die Zellverteilung nicht gleichmäßig ist. (7)–(10) und mit unterschiedlicher Intensität Gl. (16)–(17).

Wir schlagen vor, dass die Beziehung verwendet werden könnte, um die wahre Anzahl von Zellen abzuschätzen, wenn man eine zu große Schichtdicke wählt (X > Xoptimal). In vielen Anwendungen ist es für Anwender der Kryo-Bildgebung erforderlich, eine größere Schichtdicke zu wählen, um ein großes Gewebestück wie Schweineherzen5,22,23,27, Hundeherzen7,21 oder Kaninchengewebe24 zu analysieren. Da das Probenvolumen unerschwinglich groß ist, sollte eine viel größere Schichtdicke gewählt werden, um die Bildgebungszeit, den Speicherplatz und andere Kosten effizient zu optimieren. Je größer jedoch die Schichtdicke über den Xoptimal-Wert hinaus war, desto höher war die Anzahl falsch negativer Ergebnisse. Um dieses Problem zu entschärfen, schlagen wir vor, dass die in Gleichungen abgeleitete Beziehung. (14)–(15) kann verwendet werden, um die tatsächliche Anzahl von Zellen/Mikrokügelchen abzuschätzen. Wenn Forscher beispielsweise eine Mikrosphären-Bioverteilungsstudie an einem großen Tier durchführen und eine große Schnittdicke festlegen müssen, sagen wir X = 100 μm, während Xoptimal = 58 μm. Auf diese Weise konnten die in ihren Bilddaten erfassten Zellsignale mit einer Empfindlichkeit von nur 58 % (42 % Verlust) erhalten werden, wie in den Gleichungen vorgeschlagen. (14)–(15). Um dies zu korrigieren, könnte man erwägen, die Anzahl der gefundenen Mikrokügelchen mit einem Faktor von 1/Sens (1/0,58 in unserem Beispiel) zu multiplizieren, um die tatsächliche Anzahl der fluoreszierenden Mikrokügelchen im Gewebe abzuschätzen. Dieses Wissen ermöglicht es den Bedienern der Kryo-Bildgebung, größere Schichtdicken (viel größer als Xoptimal) ohne nennenswerten Verlust der Mikrokügelchen zu verwenden. Durch solche Korrekturen könnte die Scanzeit eines großen Gewebes wie eines Schweineherzens von Tagen oder Wochen auf Stunden oder Tage verkürzt werden. Diese Erkenntnis macht Analysen möglich, die zuvor möglicherweise nicht möglich waren.

Wir haben das Modell erfolgreich anhand realer Daten aus zwei unabhängigen Studien validiert. Das Modell beschreibt gut die Beobachtungen aus den realen Daten. Der erste Datensatz stammte aus einem Experiment zur Untersuchung fluoreszierend markierter Stammzellen in einem Mausmodell2,9,11,12. Der zweite Datensatz stammte aus einem anderen Experiment, das die Bioverteilung fluoreszierender Mikrokügelchen in einem Schweineherz untersuchte5,26. Durch die Durchführung einer Schnitt- und Bildsimulation dieser Datensätze wurde festgestellt, dass die gemessenen Schichtdicken- und Zelldetektionsbeziehungen gut mit denen aus In-silico-Simulationsergebnissen korrelieren (Abb. 10 und 11). Die Korrelationen zwischen den Kurven betrugen mehr als 99 %. Wir glauben, dass dieser hohe Grad der Übereinstimmung größtenteils auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die Verteilung der fluoreszierenden Zellen/Mikrokügelchen in den Datensätzen unseren Annahmen entsprach (Abb. 4B und 5). Derzeit arbeiten wir an Fällen, in denen die Zellverteilung in der Probe aufgrund von Überlappungen oder unterschiedlicher Intensität nicht mit den Annahmen übereinstimmt. Beispiele hierfür sind Lungenembolien in einem Lungengewebe nach intravenöser Injektion der Zellen (Abb. 4A), eine Tumormasse oder Metastasierung im Mausmodell4,13,14,15,16,17,18,19, eine Aggregation aktivierter Zellen Immunzellen in sekundären lymphatischen Organen3,9,11,12 usw.

Durch eine hellere Fluoreszenzintensität könnte die Schichtdicke auf einen größeren Wert eingestellt werden. Unter dem aktuellen Kryo-Bildgebungsprotokoll1,5,9,10 zeigen die Datensätze, dass die Fluoreszenzintensitätswerte (Ifluo) der roten Mikrosphäre, der grünen Mikrosphäre und der mit Quantenpunkten markierten Stammzellen etwa 300, 87 bzw. 38 lagen. Die geschätzten optimalen Schnittdicken für diese fluoreszierenden Mikrokügelchen und Zellen betrugen 102, 58 bzw. 43 μm. Wenn die Schichtdicke festgelegt werden muss, muss eine hohe Zellhelligkeit aufrechterhalten werden, damit die Signalpräsenz in den Ausgabebildern gewährleistet werden kann. Unser Modell legt nahe, dass die Zellintensität nicht niedriger sein sollte als die minimale Zellhelligkeit Ioptimal, wie in Gleichung (1) beschrieben. (6). Da die fluoreszierend markierten Zellen viel schwächer waren als die fluoreszierenden Mikrokügelchen, müssen Forscher sicherstellen, dass die Zellen mit einer Intensität fluoreszierend markiert werden, die über dem empfohlenen Wert liegt. Dies könnte auf verschiedene Weise geschehen. Ein Beispiel besteht darin, vor der In-vivo-Lieferung nur die hellen Zellen durch die fluoreszenzaktivierte Zellsortiermaschine (FACS) auszuwählen. Man sollte bedenken, dass Zellteilung, Zelltod, Photobleichung der Fluorophore und andere Faktoren zur Variation der Zellhelligkeit beitragen können. Wenn mit einem schnellen Verlust der Zellhelligkeit zu rechnen ist, könnte man zum Ausgleich eine geringere Schichtdicke verwenden. Ein weiterer Ansatz zur Erhöhung der Zellenhelligkeit besteht darin, die Belichtungszeit der Kamera zu erhöhen. Aufgrund des hohen Signal-Rausch-Verhältnisses der Fluorophore erhöht eine längere Belichtungszeit normalerweise den Kontrast der interessierenden Zellen. Auch hier ermöglichen hellere Zellen den Bedienern die Verwendung einer größeren Schichtdicke, wie in Gleichung (1) beschrieben. (5). Eine Erhöhung der Belichtungszeit führt jedoch zu einer längeren Gesamtscanzeit. Für das Scannen eines Schweineherzens (10 cm Probendicke mit 20 µm Schichtdicke, 5 × 5 Kacheln pro Schicht) kann es bei einer Belichtungszeit von 1 s bis zu 3 Tage dauern. Durch Erhöhen der Belichtungszeit auf 2 s würde die Probe etwa eine Woche brauchen, um ein Bild zu erzeugen. Man müsste die Belichtungszeit und die Schichtdicke optimieren, um die Arbeitsbelastung der Maschine auszugleichen.

Wir empfehlen Forschern, vor realen Experimenten Kalibrierungsexperimente durchzuführen, um die Beziehung „Empfindlichkeit vs. Schichtdicke“ zu erzeugen, wie in Pseudocode 2 beschrieben. Die Beziehung würde die optimalen Schichtdickenwerte ergeben, wie in Abb. 10 dargestellt. Das Kalibrierungsexperiment kann durchgeführt werden durch Schneiden des Testgewebes mit einer geringen Schichtdicke. Anschließend wird eine Schnitt- und Bildsimulation auf die Daten angewendet, um die Beziehung zwischen verschiedenen Werten der Schichtdicke und der Erkennbarkeit zu erzeugen. Die Kalibrierungsexperimente stellen sicher, dass die Schichtdicke für verschiedene Experimente optimiert wird, bei denen die Zellhelligkeit variiert.

Darüber hinaus berichteten wir über die Erkennbarkeitsmerkmale von Situationen, in denen die Schlüsselannahmen nicht zutrafen (Abb. 12, 13, 14, 15, 16, 17). Ziel der Simulationen war es, die Auswirkungen von (1) Gewebeinhomogenität, (2) Zellhelligkeitsschwankungen und (3) Zellsignalüberlappung auf die Erkennbarkeit zu untersuchen, wie sie in den Empfindlichkeits-Dicke-Kurven beobachtet werden (Abb. 13, 15, 17). Unterschiedliche Situationen führten zu unterschiedlichen einzigartigen Mustern in den Empfindlichkeits-Dicken-Kurven, wie im Abschnitt „Ergebnisse“ erläutert. Wir glauben, dass diese Eigenschaften der Kurven verwendet werden können, um zu beurteilen, ob die Schlüsselannahmen in einem Experiment zutreffen. In allen Simulationen lagen die Nachweisempfindlichkeiten nicht bei 100 %, selbst wenn der Bediener die Probe mit der optimalen Schichtdicke schnitt [wie durch Gl. (5)]. Abhängig vom Grad der Verletzung der Schlüsselannahme neigen die optimalen Punkte dazu, sich weiter zurückzuziehen (in Richtung kleinerer Werte). Daher empfehlen wir dem Bediener, eine geringere Schichtdicke zu verwenden, um die Empfindlichkeitsreduzierung zu minimieren, wenn ein Verstoß zu erwarten ist. Oftmals analysieren Forscher jeweils ein Organ, anstatt eine Probe verschiedener Gewebe zu analysieren. Zum Beispiel die Zell-/Mikrosphärenverteilung in einem einzelnen Organ, wie in diesem Artikel dargestellt. In einem solchen Fall kann die Auswirkung der µT-Variabilität minimal sein, da der Parameterwert für jeden Gewebetyp separat geschätzt werden kann. Einige Probleme, wie z. B. Überlappung von Zellsignalen oder unregelmäßige Verteilung, können mithilfe von Bildverarbeitungstechniken digital gelöst werden. Unsere Gruppe30,34 sowie andere7 schlugen Algorithmen vor, die zwei (oder mehr) überlappende Fluoreszenzsignale unter der Oberfläche in den Kryobildgebungsdaten effektiv trennen können.

Schließlich haben wir gezeigt, dass die Kryo-Bildgebungstechnologie verwendet werden kann, um fluoreszierende Zellen und Mikrokügelchen überall im gesamten Tier mit mikroskopischer Empfindlichkeit zu verfolgen. In dieser Studie wurden Datensätze aus zwei verschiedenen Experimenten verwendet. Dazu gehörten fluoreszierend markierte Zellen in einem Mausmodell (Abb. 4) und fluoreszierende Mikrokügelchen in einem Schweineherz (Abb. 5). Mit sorgfältig ausgewählten Bildgebungsparametern könnte die Kryo-Bildgebung eine Wiederherstellungsrate (Anzahl der Erkennungen/Abgabe) von bis zu 94 % erzielen. Wir glauben, dass die Kryo-Bildgebung Bilddaten mit ähnlichen Wiederherstellungsraten in anderen biologischen Anwendungen wie der Arzneimittelabgabe, Blutperfusion, Krebsmetastasierung usw. liefern könnte.

Abschließend stellten wir ein Modell vor, das die Beziehung zwischen der Erkennung fluoreszierender Zellen und der Schichtdicke für ein Schnitt- und Bild-Kryo-Bildgebungssystem beschreibt. Das Modell könnte verwendet werden, um den optimalen Schichtdickenwert vorzuschlagen, der eine ideale Erkennung fluoreszierender Zellen bei gleichzeitiger Minimierung der Scanzeit gewährleistet. Wir haben das Modell auch mithilfe fluoreszierender Mikrosphärendaten und fluoreszierend markierter Stammzelldaten erfolgreich validiert. Das Modell bietet außerdem einen Korrekturfaktor, um eine verminderte Empfindlichkeit bei suboptimaler Schichtdicke zu berücksichtigen. Wir empfehlen, für jeden Scan einen Dünnschichtkalibrierungsdatensatz zu erfassen, der eine absolute Quantifizierung der räumlichen Fluorophorverteilung beinhaltet und so als Qualitätssicherung für den Fall dient, dass eine Korrektur erforderlich ist. Da die Kryo-Bildgebungstechnologie in vielen biologischen Anwendungen eingesetzt wird, trägt diese Arbeit dazu bei, sowohl den experimentellen Durchsatz als auch die Qualitätssicherung zu steigern und so ihre Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit weiter zu verbessern.

Die Datensätze und Quellcodes, die während der aktuellen Studie verwendet/generiert/analysiert werden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde teilweise von folgenden Quellen finanziert: Chiang Mai University, Thailand (PW), das Coordinating Centre for Thai Government Science and Technology Scholarship Students oder CSTS Thailand (PW), die National Science and Technology Development Agency oder NSTDA Thailand (PW). ), die National Institutes of Health NIH R42CA124270 (DLW), NIH T32EB007509 (BLE und DLW), NIH R01EB028635 (DLW), NIH R43GM145205 (MG) und Ohio Third Frontier: Cardiac Perfusion with Computed Tomography (BLE und DLW). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH und anderer Förderagenturen wieder.

Wir danken Prof. Kenneth R. Cooke, MD (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Baltimore, MD) für die Bereitstellung der Mausmodelldaten, Prof. Hiram G. Bezerra, MD Ph.D. (University Hospitals Cleveland Medical Center, Cleveland, OH) für die Bereitstellung der Schweinemodelldaten, Wouter Van't Hof, Ph.D. (Cleveland Cord Blood Center, Cleveland, OH) und Athersys Inc. (Cleveland, OH) für die Bereitstellung der MAPC-Zelllinie. Wir möchten außerdem Saada Eid, Steve Schomisch und Cassie Cipriano (Case Western Reserve University, Cleveland, OH) für ihre Unterstützung bei Tierversuchen danken.

Institut für Biomedizintechnik, Abteilung für Computertechnik, Exzellenzzentrum für Infrastrukturtechnologie und Verkehrstechnik, Universität Chiang Mai, Chiang Mai, 50200, Thailand

Patiwet Wuttisarnwattana

Imaging Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, 44195, USA

Brendan L. Eck

BioInVision Inc., Mayfield Village, OH, 44143, USA

Madhusudhana Gargesha

Abteilung für Biomedizintechnik, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, 44106, USA

Brendan L. Eck und David L. Wilson

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PW war maßgeblich an der Entwicklung der Konzepte und Methoden, der Bildverarbeitung und -interpretation sowie am Verfassen des Manuskripts beteiligt. BLE leistete den Hauptbeitrag zur Entwicklung der räumlichen Verteilungsmodelle, wie in den Gleichungen beschrieben. (7)–(10) und (16)–(17). PW, BLE und MG führten die Bildaufnahme, Datenerfassung und Datenverarbeitung durch. BLE, MG und DLW führten eine Datenanalyse und -interpretation durch und verfassten das Manuskript. Das DLW hat diese Forschung finanziell unterstützt. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Patiwet Wuttisarnwattana oder David L. Wilson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wuttisarnwattana, P., Eck, BL, Gargesha, M. et al. Optimale Schichtdicke für eine verbesserte Genauigkeit der quantitativen Analyse der Verteilung fluoreszierender Zellen und Mikrokügelchen in Kryobildern. Sci Rep 13, 10907 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37927-y

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Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 29. Juni 2023

Veröffentlicht: 05. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37927-y

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