Raumzeitliche transkriptomische Karten ganzer Mausembryonen zu Beginn der Organogenese

Nature Genetics Band 55, Seiten 1176–1185 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Für eine ordnungsgemäße Embryonalentwicklung ist eine räumlich-zeitliche Orchestrierung der Genexpression erforderlich. Der Einsatz von Einzelzelltechnologien ermöglicht eine verbesserte Auflösung früher regulatorischer Dynamiken, einschließlich detaillierter molekularer Definitionen der meisten Zellzustände während der Mausembryogenese. Hier haben wir Slide-seq verwendet, um räumliche transkriptomische Karten vollständiger embryonaler Tag (E) 8.5 und E9.0 sowie teilweiser E9.5-Embryonen zu erstellen. Um ihren Nutzen zu unterstützen, haben wir sc3D entwickelt, ein Tool zur Rekonstruktion und Erforschung dreidimensionaler „virtueller Embryonen“, das die quantitative Untersuchung regionalisierter Genexpressionsmuster ermöglicht. Unsere Messungen entlang der embryonalen Hauptachsen des sich entwickelnden Neuralrohrs ergaben mehrere bisher nicht annotierte Gene mit unterschiedlichen räumlichen Mustern. Wir haben auch die widersprüchliche Transkriptionsidentität von „ektopischen“ Neuralrohren charakterisiert, die in Tbx6-mutierten Embryonen entstehen. Zusammenfassend präsentieren wir einen experimentellen und rechnerischen Rahmen für die räumlich-zeitliche Untersuchung ganzer embryonaler Strukturen und mutierter Phänotypen.

Die Embryonalentwicklung erfordert die genaue zeitliche Abstimmung und Lokalisierung zahlreicher Prozesse auf molekularer, zellulärer und Gewebeebene1,2,3,4,5. Diese Ereignisse werden über die räumlich-zeitliche Kontrolle der Genexpression gesteuert, die die Spezifikation, Migration und Lokalisierung des Zelltyps koordiniert6,7,8,9. Jede Störung dieser Regulierung führt häufig zur embryonalen Letalität oder zu Entwicklungsstörungen5,10,11. Am Ende der Gastrulation und dem Beginn der Organogenese (embryonale Tage (E) 8,5–9,5) erfahren die Gewebe große morphologische Veränderungen, wie z. B. Herzschleifen, Gehirnkompartimentierung und Faltung des Neuralrohrs, um eine ordnungsgemäße Struktur und Funktion zu gewährleisten12,13,14. Durch Neurulation falten sich Epithelzellen in der Neuralplatte, um eine morphologisch definierte Röhre zu bilden, die eine geschichtete Genexpressionssignatur entlang ihrer dorsoventralen (DV)-Achse aufweist, die für die anschließende Diversifizierung der neuronalen Subtypen notwendig ist15,16,17,18,19,20 ,21. Viele an diesem Prozess beteiligte Gene wurden identifiziert, die genauen Genregulationsnetzwerke, die diese Muster steuern, werden jedoch noch untersucht. Jüngste Einzelzellstudien haben begonnen, ein tieferes Verständnis der Topographie der Schicksalsspezifikation zu liefern und einige molekulare Mechanismen hervorzuheben, die diesen Zellzustandsübergängen zugrunde liegen22,23,24,25,26,27,28. Eine Einschränkung dissoziationsbasierter Ansätze ist ihre Unfähigkeit, die Gewebestruktur zu bewahren, was eine Expressionsanalyse im nativen Kontext ausschließt. Jüngste Fortschritte bei räumlichen Transkriptomtechnologien haben begonnen, diese Lücke zu schließen und zielen darauf ab, die Organisation von Zelltypen in erwachsenen Geweben und sich entwickelnden Embryonen zu erforschen29,30,31,32,33,34,35,36,37,38.

In dieser Studie verwendeten wir Slide-seq, eine Technologie, die transkriptomweite Genexpressionsdaten mit einer räumlichen Auflösung von 10 µm33,39 generiert, um Karten ganzer Embryonen während der frühen Organogenese der Maus zu erstellen. Unsere Daten ermöglichten die Erforschung räumlicher Genexpressionsmuster, Zellzustandsverteilungen, die Rekonstruktion dreidimensionaler (3D) Transkriptomkarten für die „virtuelle“ Genexpressionsanalyse und die Zerlegung mutierter Phänotypen. Wir haben die Daten gezielt genutzt, um regionalisierte Genexpressions- und Differenzierungsverläufe im Weltraum zu identifizieren, wobei wir uns auf die Bildung und Strukturierung von Neuralrohren konzentrierten. Insgesamt stellen wir einen umfassenden, hochauflösenden räumlichen Atlas zusammen mit einem zugänglichen und gebrauchsfertigen Visualisierer zur Verfügung, um Genexpressionsmuster im sich entwickelnden Mausembryo zu untersuchen.

Um Zellidentitäten während der frühen Organogenese räumlich abzubilden, verwendeten wir Slide-seq für zwei repräsentative E8.5-, einen E9.0- und drei partielle E9.5-Embryonen (Abb. 1a und Extended Data Abb. 1a). Für die beiden E8.5-Embryonen erhielten wir 15 bzw. 17 Sagittalschnitte (10 µm Dicke) mit Abständen von etwa 30 µm dazwischen. Für den E9.0-Embryo wurden 26 Sagittalschnitte mit 20-µm-Intervallen und für die drei E9.5-Embryonen 13 Schnitte von der Mittellinie erhalten (Abb. 1a und Ergänzungstabelle 1). Insgesamt haben wir 533.116 hochwertige Perlen mit einem Medianwert von 1.798 Transkripten und 1.224 Genen pro Perle gewonnen (Extended Data Abb. 1b – d). Um die jeder Perle zugeordneten Zellzustände zu ermitteln, haben wir Perlen rechnerisch einer zuvor generierten Einzelzellenreferenz zugeordnet (Extended Data Abb. 1e, f)26. Mit diesen Informationen extrahierten wir aus jeder sequenzierten Perle (1) räumliche Koordinaten, (2) das zugehörige Genexpressionsprofil und (3) die Zellzustandszuordnung. Insgesamt beobachteten wir eine gute Ausrichtung der Zellzustände und eine räumliche Einschränkung von Markergenen, wie unter anderem Ttn (Herz), T (Schwanzknospe), Meox1 (Somiten) und Sox2 (Neuralrohr, Gehirn) (Extended Data Abb. 2a). –e). Darüber hinaus beobachteten wir eine hohe Reproduzierbarkeit bei der Wiederherstellung einer vergleichbaren Embryonenzusammensetzung und Genexpressionsmustern unter den Replikaten (Erweiterte Daten, Abb. 2c – f).

a, Schema des experimentellen Arbeitsablaufs und der Datenanalyse. Für Slide-seq wurden sagittale Schnitte von Mausembryonen bei E8.5, E9.0 und E9.5 erhalten. Die gestrichelten Linien geben die ungefähre Position der Embryonalabschnitte an. b,c, 3D-rekonstruierte Embryonen im Stadium E8.5 (b) und E9.0 (c) mit sechs hervorgehobenen Zellzuständen (Gehirn, Herz, Neuralrohr, Somiten, NMPs, PSM); Das kaudale Markergen Cdx2 und das Herzschlauch-Markergen Ttn sind in einem vISH des rekonstruierten E8.5-Embryos1 dargestellt (normalisierte Genexpression). Jeder Punkt entspricht einer einzelnen Perle. Der Standpunkt wird durch das Augensymbol gekennzeichnet. Maßstabsbalken, 100 µm. d, 3D-Ansicht eines E8.5-Embryos mit den angegebenen Zellzuständen und anatomischen Merkmalen im Hellfeld (links) oder abgebildet auf den E8.5-Embryo1 (rechts). Es werden verschiedene Ausrichtungen angezeigt. Maßstabsbalken, 500 µm. e, Schematische Darstellung der Strategie zur Identifizierung der lokalisierten Genexpression in Geweben. f, Heatmap der Lokalisierungswerte für die 20 wichtigsten räumlich unterschiedlich exprimierten Gene in 3D für jedes analysierte Gewebe im E8.5-Embryo1 (Liste siehe Ergänzungstabelle 4). Die 20 wichtigsten Gene (Reihen-Z-Score-normalisiert) im Gehirn sind hervorgehoben. A, anterior; LPM, seitliches Plattenmesoderm; P, hinten; D, dorsal; V, ventral; LPM, seitliches Plattenmesoderm; NMPs, neuromesodermale Vorläufer; PSM, präsomitisches Mesoderm.

Um unsere zweidimensionalen Daten in einen 3D-Embryo zu übersetzen, haben wir sc3D entwickelt, eine Berechnungsmethode, die die Ausrichtung einzelner räumlicher transkriptomischer Arrays für die 3D-Rekonstruktion ermöglicht. Insbesondere haben wir sc3D verwendet, um serielle Slide-seq-Z-Proben von E8.5- und E9.0-Embryonen auszurichten, wodurch wir die räumliche Verteilung und Morphologie der entstehenden Gewebe zu Beginn der Organogenese erfassen konnten (Extended Data Abb. 3a). ,b und ergänzende Abbildungen 1 und 2). Dies wiederum ermöglichte quantitative Messungen ihrer Volumina (250–39.264 × 103 µm3), die über einzelne replizierte Embryonen hinweg reproduzierbar waren (Extended Data Abb. 3c – e, ergänzende Abbildung 1, ergänzender Film 1 und ergänzende Tabelle 2). Wir haben weiterhin gezeigt, dass die Rekonstruktion mit zunehmendem Intervall zwischen den Schichten konsistent blieb und eine sehr minimale Verzerrung in den Rotationsachsen aufwies (Extended Data Abb. 3f). Wichtig ist, dass sc3D auch die 3D-Rekonstruktion anderer räumlicher Transkriptomdatensätze mit hoher Präzision, Geschwindigkeit und Robustheit bei reduzierter räumlicher Auflösung ermöglicht (40) (Erweiterte Daten, Abb. 4a – c und Ergänzungstabelle 3).

Als nächstes verwendeten wir die rekonstruierten Embryonen, um eine „virtuelle“ In-situ-Hybridisierung (vISH) von über 27.000 Genen auf quantitativer Ebene durchzuführen, mit der Möglichkeit, die Gradientengenexpression entlang einer beliebigen Körperachse, Neigungsebene und Rotationswinkel abzufragen (Abb. 1b– d, Ergänzende Abbildungen 1 und 2 und Ergänzende Filme 1–4). Um die Zugänglichkeit von sc3D weiter zu verbessern, haben wir sc3D-Viewer entwickelt, eine benutzerfreundliche und interaktive Umgebung zur Erkundung der UMAP-Darstellung (Uniform Manifold Approximation and Projection), räumlicher Zellzustandskarten und vISH für Einzel- und Doppelgenkombinationen (Methoden in den Zusatzinformationen). ). Um die räumliche Genexpression innerhalb jedes Gewebetyps zu untersuchen, haben wir die genomweiten Korrelationen zwischen Gewebevolumina und Dichten exprimierender Zellen berechnet, um einen Lokalisierungswert zu erstellen, der es uns ermöglichte, Gene innerhalb jedes Gewebes basierend auf ihrer räumlichen Einschränkung bei der Expression einzustufen. Diese Analyse identifizierte eine Reihe äußerst informativer, gewebespezifischer, regionalisierter Gene innerhalb des Embryos und über Replikate hinweg sowie Entwicklungsstadien (Abb. 1e, f und 2a, erweiterte Daten Abb. 4d – g und Ergänzungstabelle 4). Beispielsweise fanden wir hohe Lokalisierungswerte für Gene wie Nppa, Tdgf1, Cck und Sfrp5 im sich entwickelnden Herzschlauch (Extended Data Abb. 5a – d und Zusatzfilm 5). Die Kartierung dieser Gene auf unserem digitalen Embryo ergab, dass ihre Expressionsdomänen spezifische Entwicklungsachsen (anterior-posterior (AP), DV und rechts-links) markieren und mutmaßliche anatomische Strukturen wie die primitiven Ventrikel und Vorhöfe, den Ausflusstrakt und den Kardiomyozyten abgrenzen Gelee bzw. der Venenpol 41, 42, 43, im Gegensatz zur räumlich allgegenwärtigen Genexpression im Blut (Extended Data Abb. 5c – e). Darüber hinaus unterscheidet die Cck- und Sfrp5-Expression räumlich differenzierte von undifferenzierten Kardiomyozytendomänen (Extended Data Abb. 5d)41,42,43. Zusammengenommen zeigt dies unsere Fähigkeit, regionalisierte Marker zu identifizieren und die unterschiedliche Domänenorganisation innerhalb komplexer sich entwickelnder Gewebe entlang der Entwicklungsachsen zu untersuchen.

a, Schematische (links) und normalisierte räumliche Darstellung der Genexpression (rechts) ausgewählter Gene (hervorgehoben in Abb. 1f) im 3D-Gehirn von E8.5-Embryo1, E9.0 und E9.5 (Array E9.5_3). Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Perle. b, Räumliches Diagramm der RNA-Geschwindigkeit in der Gehirnregion E9.5 (Array E9.5_3). Die Vektorrichtung gibt die Flugbahn an und die Länge gibt die Größe an. Regionen mit niedriger Geschwindigkeit werden als R1, R2, R3 und R4 angegeben. R1, Prosencephalon der Neuralleiste; R2, Telencephalon-Zwischenhirn-Grenze; R3, Zwischenhirn-Mittelhirn-Grenze; R4: Grenze zwischen Mittelhirn und Hinterhirn; und R5, Grenze zwischen Hinterhirn und Rückenmark. c, Räumliches Diagramm, das die Gehirngrenzen (oben) und oben angereicherte, räumlich unterschiedlich exprimierte Gene entlang der Gehirngrenzen R2, R3 und R4 (dargestellt als Zeilen-Z-Score-normalisierte Expression) bei E9.5 (Array E9.5_3) zeigt. Die vollständige Liste der Gene finden Sie in der Ergänzungstabelle 5. Maßstabsleiste für alle Diagramme, 50 µm. C, kaudal; D, dorsal; R, rostral; V, ventral.

Zwischen E8.5 und E9.5 entwickelt sich der vorderste Teil des Neuralrohrs in drei verschiedene Vesikel (Vorhirn-Vorderhirn, Mittelhirn-Mittelhirn und Rautenhirn-Hinterhirn), die zusammen das Urhirn bilden20,21,44,45,46 ,47. Unsere hochauflösende räumliche Transkriptomkarte des Vorderhirn-Prosenzephalons in E9.5-Embryonen ermöglichte es uns, mutmaßliche Telenzephalon- und Zwischenhirnregionen zu identifizieren und die DV-Musterung des Zwischenhirns-Mittelhirns abzugrenzen (Extended Data Abb. 6a–e)48. Um die Entstehung solcher Muster zu untersuchen, analysierten wir das Transkriptom der Gehirne E8.5, E9.0 und E9.5 und stellten fest, dass Gene wie Foxg1, Barhl2, Otx2, En1 und Egr2 bereits bei E8.5 regionalisierte Expressionsmuster aufweisen ( Abb. 1f und 2a). Während Foxg1 auf das rostrale Prosencephalon beschränkt war und das präsumtive Telencephalon definierte, wurde Barhl2 kaudal exprimiert und markierte bereits das präsumtive Zwischenhirn49,50,51. Rax, ein Marker des sich entwickelnden Auges, zeigte eine räumliche Beschränkung der Genexpression zwischen E8.5 und E9.5 und definierte den zukünftigen Augenbecher (Abb. 2a). Es scheint daher, dass die räumliche Einschränkung der Genexpression der anatomischen Segregation vorausgeht. Um den Zusammenhang zwischen der Festlegung des Zellschicksals und der räumlichen Beschränkung entstehender Strukturen weiter zu untersuchen, verwendeten wir eine unbeaufsichtigte räumliche RNA-Geschwindigkeit ohne vorherige Kenntnis der Zellzustände52. Wir haben unterschiedliche Bereiche der Geschwindigkeitsdynamik mit entweder konvergierenden oder divergierenden Trajektorien wiederhergestellt, die möglicherweise schrittweisen Übergängen oder zellulären stationären Zuständen entsprechen (Abb. 2b und erweiterte Daten Abb. 7a, b). Eine genauere Untersuchung von Regionen mit niedriger Geschwindigkeit (definiert durch die Länge bei niedriger Geschwindigkeit und das Vertrauen der Vektordirektionalität) in Kombination mit der Expression bekannter Markergene ergab das Vorhandensein von Vorläuferfelddomänen (vorderer Neuralgrat R1) sowie differenzierter Neuronen Territorien (R5-Hinterhirn-Rückenmark-Grenze) (Extended Data Abb. 6b, c und 7c). Darüber hinaus wurden in Bereichen mit divergierenden Trajektorien Grenzregionen hervorgehoben, beispielsweise die R4-Mesencephalon-Rhombencephalon-Grenze, die durch die restriktiven und exklusiven Expressionsmuster von Otx2 im Mesencephalon und Gbx2 im Rhombencephalon sowie Fgf8 an der Grenze gekennzeichnet war (Erweiterte Daten). Abb. 7c)53.

Obwohl Vektorenden nicht unbedingt einen terminal differenzierten Zustand darstellen, könnte eine solche Beziehung abgeleitet werden, wenn bekannt ist, dass räumliche Trajektorien mit Entwicklungsmusterprozessen übereinstimmen. Beispielsweise ähneln die bei R4 beobachteten Trajektorien der Abstammungsspezifikation der Vorläufer des mittleren Hinterhirns, die neuronale Zellen erzeugen, die anschließend das gesamte Mittelhirn und die vorderen Hinterhirnbereiche bevölkern21. Darüber hinaus ermöglichte unsere hochauflösende Karte eine detailliertere Betrachtung der molekularen Determinanten sich entwickelnder Grenzen vor der Bildung anatomischer Verengungen (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 5). Wir haben die drei Grenzen analysiert, die die Haupthirnregionen abgrenzen, um Merkmale zu identifizieren, die Aufschluss über die Regulierungsmechanismen geben könnten, die an der Regionalisierung des Gehirns beteiligt sind. In R2 und R4 haben wir mehrere Signalmoleküle (WNT, FGF) und nachgeschaltete Effektoren identifiziert, die die Rolle dieser Grenzen als Signalzentren bestätigen, die die Strukturierung der angrenzenden Strukturen (der Zona limitans intrathalamica (ZLI) und des isthmischen Organisators) steuern. Während das Zusammenspiel zwischen WNT- und FGF-Signalisierung in der Mittel-Hinterhirn-Grenze (R4) gut bekannt ist, wurde ihre Rolle an der Telencephalon-Diencephalon-Grenze (R2), wo die SHH-Signalisierung eine wichtige Rolle spielt54, weniger untersucht. In dieser Studie zeigen wir die räumliche Beschränkung der Wnt7b-Expression auf die Grenze zusammen mit Wnt8b (Extended Data Abb. 7d). Obwohl Wnt7b im rostralen und dorsalen Teil des Zwischenhirns exprimiert wird55, wurde seine Koexpression und Kolokalisierung mit Wnt8b, von dem bekannt ist, dass es im ZLI56 exprimiert wird, noch nicht beschrieben. Im Vergleich zu den anderen analysierten Regionen zeichnet sich die Zwischenhirn-Mittelhirn-Grenze (R3) durch eine geringe Signalmolekülaktivität, eine hohe neuronale Markerexpression (Neurofilamentproteine ​​und neuronale Gene) und eine konvergente RNA-Geschwindigkeitssignatur aus, was eher auf das Vorhandensein eines ausgereifteren neuronalen als hindeutet eine Vorläuferdomäne (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 5). Daher kann unsere Analyse dabei helfen, relevante Moleküle wie CDH8 zu identifizieren (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 5), von dem bekannt ist, dass es die Grenze zwischen Zwischenhirn und Mittelhirn zusammen mit anderen Cadherinen kompartimentiert. Darüber hinaus haben wir innerhalb der Vorderhirnregion sowohl bekannte als auch nicht charakterisierte Genexpressionsverteilungen kartiert, einschließlich derjenigen, die an der Augenentwicklung beteiligt sind (Extended Data Abb. 7e, f). Durch die Untersuchung solcher Muster während der frühen Gehirnentwicklung haben wir die räumliche Entstehung anatomischer Strukturen geschichtet.

Während sich das vordere Neuralrohr zum Gehirn entwickelt, bildet der hintere Teil bei der Rumpfverlängerung das zukünftige Rückenmark. Der embryonale Rumpf besteht aus morphologisch unterschiedlichen Strukturen mit unterschiedlichen Entwicklungsursprüngen, die eine korrekte axiale Verlängerung und Körperplansegmentierung gewährleisten (Abb. 3a)58,59,60. Während sich der Embryo entwickelt, erwerben axiale Vorläuferzellen ein bipotentes Differenzierungspotential, das die Erzeugung neuroektodermaler und mesodermaler Derivate ermöglicht58,59,60. Insbesondere erzeugen diese Zellen, die als neuromesodermale Vorläuferzellen (NMPs) bekannt sind, den hinteren Teil des Neuralrohrs und das paraxiale Mesoderm über die Bestimmungsfront (präsomitisches (PSM) und somitisches Mesoderm) (Abb. 3a)58,59,60 . Um die Regionalisierung der Genexpression im sich entwickelnden Stamm in 3D zu profilieren, haben wir zunächst die Zellzustände, die den NMPs, PSM und Somiten (Somitogenese-Trajektorie) entsprechen, auf unseren virtuellen E8.5-Embryo abgebildet (Abb. 3b). Der vISH von Tbx6, Ripply2 und Meox1 bestätigte außerdem die organisierten Genexpressionsmuster entlang der AP und der Rechts-Links-Symmetrie, die an der Somitogenese beteiligt sind (Abb. 3b). Um zu verstehen, wie sich eine regionalisierte Genexpressionssignatur auf die Entwicklungsdynamik auswirkt, haben wir anschließend ein Profil der Rumpfentwicklungsverläufe erstellt, indem wir transkriptionelle Pseudozeitmessungen mit räumlichen Informationen kombiniert haben. UMAP und räumliche Visualisierung zeigten ein Kontinuum transkriptomischer Zustände entlang der somitischen und neuronalen Trajektorien (Abb. 3c, d und erweiterte Daten Abb. 8a – c). Als nächstes untersuchten wir diese Beziehung detaillierter und berechneten die transkriptionellen und räumlichen Abstände für jede Perle zu jeder anderen Perle innerhalb jedes Stammgewebes in einem E9.5-Embryo („pseudozeitliche“ bzw. „räumliche“ Abstände) (Abb. 3e)61 ,62,63. Interessanterweise haben wir herausgefunden, dass Veränderungen in Transkriptomen nicht unbedingt proportional zu Zell-Zell-Abständen sind und dass ihre Beziehung gewebespezifisch ist. Insbesondere Vorläuferzellen (NMPs und PSM) besetzen einen kleinen Bereich des Embryos und weisen geringe räumliche Abstandsverteilungen bei gleichzeitig geringer Transkriptionsvariabilität auf (Abb. 3e). Andererseits sind differenziertere Zellen (Neuralrohr und Somiten) auch bei geringen Transkriptionsunterschieden weit über die Rumpfregion verteilt (große Distanzverteilung) (Abb. 3e). Wir beobachteten auch eine Gruppe proximaler Zellen im Neuralrohr, die durch eine bemerkenswerte Transkriptionsvariabilität gekennzeichnet waren und bei der Zuordnung zu räumlichen Arrays eine lokale DV-Musterung darstellten (Abb. 3e gepunktete Linie und Abb. 3f). Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass sich Vorläufer während der Rumpfentwicklung in einem begrenzten räumlichen Bereich in nachfolgende Zellzustände differenzieren, bevor sie sich ausbreiten.

a, Schematische Darstellung der räumlichen Organisation von Zellzuständen in der embryonalen Rumpfregion bei E8.5 und Nahaufnahme des Prozesses der Somitogenese. b, Schematisches und räumliches 3D-Diagramm von E8.5 (Embryo2), das ausgewählte Zellzustände und vISH von Tbx6, Ripply2 und Meox1 in der Rumpfregion zeigt. Jeder Punkt bezeichnet eine Perle und die Farbe entspricht dem angegebenen Zustand. Maßstabsbalken, 200 µm. c, UMAP zeigt Perlen aus E8.5- und E9.5-Embryonen, die den NMPs, PSM, Somiten und Neuralrohrzuständen entsprechen (links) und die entsprechende räumliche Verteilung (rechts) in einem E9.5-Embryo (Array E9.5_2). Jeder Punkt bezeichnet eine Perle und die Farbe entspricht dem angegebenen Zustand. Maßstabsbalken, 100 µm. d, UMAP, das eine Pseudozeitanalyse entlang der Trajektorien der somitischen und neuronalen Differenzierung (links) und die entsprechende räumliche Verteilung (rechts) in einem E9.5-Embryo (Array E9.5_2) zeigt. Jeder Punkt bezeichnet eine Perle und die Farbe entspricht dem zugewiesenen Pseudozeitwert. Maßstabsbalken, 100 µm. e, Dichtediagramm, das die berechnete Pseudozeitdifferenz (y-Achse) gegenüber dem gemessenen räumlichen Abstand (x-Achse) zwischen allen Perlen desselben Zellzustands anzeigt. Jeder Punkt ist ein paarweiser Vergleich. Die gepunktete Linie markiert Zellen mit geringem räumlichen Abstand und großer Transkriptionsdivergenz im Neuralrohr. f, Räumliches Diagramm, das die Perlen (oben) innerhalb der gepunkteten Linie (Abb. 2e) und die Verteilung der Pseudozeitwerte in einem E9.5-Embryonalstamm (Array E9.5_3) zeigt, der die Strukturierung des Neuralrohrs widerspiegelt. Jeder Punkt stellt eine Perle dar. Maßstabsbalken, 100 µm.

Während sich der Rumpf entwickelt und sich Gewebe im Raum ausdehnt, bestimmen die Transkriptionsunterschiede entlang seiner Länge die Positionsidentität verschiedener Zellzustände. Beispielsweise faltet sich zwischen E8,5 und E10,5 das Neuralrohr aus der Neuralplatte und wird einer Strukturierung unterzogen, um die Zellschichtung für das zukünftige Rückenmark festzulegen16,17,19,20,21,62,63,64. Regionalisierte Genexpressionsprogramme garantieren eine weitere Diversifizierung neuronaler Typen entlang der AP- und DV-Achse16,17,19,20,21,62,63,64. Um die genetischen Programme zu verstehen, die an der Etablierung der diskreten Vorläuferdomänen entlang des Neuralrohrs beteiligt sind, isolierten wir die entsprechenden Perlen und suchten nach räumlichen Koexpressionsmustern entlang der AP- (ca. 4.600 µm) und DV-Achse (ca. 320 µm) („Achsenprofilierung“) ') (Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 8d). Wir identifizierten unterschiedliche Expressionsmuster entlang der AP-Achse des Neuralrohrs für Gene, die an mehreren zellulären und molekularen Funktionen beteiligt sind (Extended Data, Abb. 8e). Wie erwartet gehörten Hox-Gene zu den am weitesten lokalisierten Genen innerhalb dieser Achse (Abb. 4b)65,66. HOX-Faktoren interagieren miteinander, um Transkriptionsprogramme zu regulieren. Um mutmaßlich funktionell kollineare Gruppen zu identifizieren, führten wir eine Hox-Genmodulanalyse in Kombination mit räumlicher Auflösung durch und fanden sechs verschiedene Module der Hox-Genexpression, vom vordersten Modul (Hox-Modul I, bestehend aus Hoxb2 und Hoxa3) bis zum hintersten Modul (Hox-Modul). VI, enthält Hoxd8 und Hoxa9 (Abb. 4c und erweiterte Daten Abb. 8f, g). Als nächstes untersuchten wir die DV-Achse des Neuralrohrs und konnten gut untersuchte Strukturen wie das Notochord, die Bodenplatte, das eigentliche Neuralrohr und die Dachplatte basierend auf ihrer räumlich eingeschränkten Transkriptionssignatur (Abb. 4a, d und erweiterte Daten Abb. 9a, b)29. Unter den räumlich am stärksten eingeschränkten Genen fanden wir bekannte abstammungsdefinierende Marker wie Zic1 , Pax3, Olig2, Nkx6-1 und Nkx2-9, was wir mithilfe der RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) weiter bestätigten (Abb. 4d – f und Extended Data Abb. 9c – e). Wir identifizierten außerdem 43 zusätzliche Gene in das frühe Maus-Neuralrohr im E9.5-Stadium, das offenbar eine gemusterte Expression entlang der DV-Achse in der ventrikulären Zone aufweist, die Vorläufer enthält (Abb. 4d–f, Erweiterte Daten Abb. 9f und Ergänzungstabelle 7). Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen des Achsenprofilierungstools bei der Erkennung gut untersuchter Genexpressionsmuster entlang der Neuralrohrachse und seine Anwendung bei der De-novo-Entdeckung von Genen mit lokal eingeschränkter Expression.

a, Schema eines Embryos im E9.5-Stadium mit Perlen, die dem Neuralrohr (grün) entsprechen, und den angegebenen Achsen, entlang derer die Profilierung durchgeführt wurde (Array E9.5_10). b, Heatmap mit den 160 wichtigsten Genen mit Expressionsmustern (Reihen-Z-Score-normalisiert, gefiltert nach einer logarithmischen Faltungsänderung von mehr als 0,05 und einer Falscherkennungsrate (FDR) < 0,01; die Liste der Gene finden Sie in der Ergänzungstabelle 7). die 25 generierten räumlichen Bins entlang der AP-Achse. Die Expression von Hox-Genen ist hervorgehoben (rechts). Maßstabsbalken, 184 µm. c, Räumliche Diagramme, die den normalisierten Ausdruck (Bin-Z-Score) von Hox-Modulen (I, II, III, IV, V, VI) im Neuralrohr E9.5 (Array E9.5_10) zeigen. Für jedes Modul sind zwei repräsentative Gene angegeben. Maßstabsbalken, 100 µm. d, Heatmap mit den 160 wichtigsten Genen mit Expressionsmustern (Reihen-Z-Score-normalisiert, gefiltert nach einer logarithmischen Faltungsänderung von mehr als 0,05 und FDR < 0,01; die Liste der Gene finden Sie in der Ergänzungstabelle 7) in den acht generierten räumlichen Bins entlang der DV-Achse. Die Expression bekannter strukturierter und von uns identifizierter Gene wird hervorgehoben. Maßstabsbalken, 40 µm. e, RNA-FISH zeigt die Validierung bekannter (oben) und unserer identifizierten (unten) Muster entlang der DV-Achse des Neuralrohrs. In den Bildern ist ein einzelner Gewebeschnitt aus dem hinteren Teil des Neuralrohrs dargestellt. n = 3 Embryonen mit reproduzierbarem Färbemuster für jedes profilierte Ziel aus WT-Embryonen. Maßstabsbalken, 50 µm. f, Schematische Darstellung der räumlichen Muster bekannter (innerhalb der Röhre) und unserer identifizierten (außerhalb der Röhre) Gene entlang der DV-Achse des Neuralrohrs im Stadium E9.5.

Nach der Katalogisierung des räumlichen Transkriptoms, das den sich entwickelnden Neuralrohrachsen zugrunde liegt, untersuchten wir einen klassischen embryonalen mutierten Phänotyp, bei dem ektopische Neuralrohre entstehen. Der T-Box-Transkriptionsfaktor TBX6 wird im PSM exprimiert und ist für die Segmentierung und Spezifikation von Somiten erforderlich10. Bei Embryonen, denen Tbx6 fehlt, entstehen ektopische Neuralrohre auf Kosten der somitischen Kompartimente (Abb. 5a)11,67. Um die genaue molekulare Identität der ektopischen Neuralrohre zu bestimmen, verwendeten wir eine CAS9-basierte Störung von Tbx6 in Zygoten und führten Slide-seq an transversalen Embryoschnitten des E9.5-Wildtyps (WT) und der Tbx6-Mutante (Tbx6-Knockout (KO)) durch , wobei der Schwerpunkt auf dem hinteren Segment der Rumpfregion liegt, wo in Abwesenheit von Tbx6 mehrere Röhren entstehen (Abb. 5a und erweiterte Daten Abb. 10a–c)26,68,69,70. Wie erwartet beobachteten wir in Tbx6-KO-Embryonen im Vergleich zu WT-Kontrollen eine Überrepräsentation der dem Neuralrohrcluster zugeordneten Perlen sowie einen entsprechenden Mangel an somitischen Zellen (Abb. 5a).

a, Querschnitt von DAPI-gefärbten Embryonen (oben) und räumliches Diagramm (unten), das die kommentierten Gewebemorphologien (Somiten, Neuralrohr) und die entsprechenden Zellzustände in E9.5 WT- und KO-Embryonen zeigt. Das KO-Experiment wurde insgesamt fünf Mal unabhängig voneinander mit n > 5 Embryonen pro Experiment durchgeführt und ergab durchweg den gleichen Phänotyp. Das Slide-seq-Experiment wurde an einem repräsentativen Querschnitt für WT- und zwei für KO-Embryonen durchgeführt. b, Räumliche Gitterkarte, die die Organisation von Neuralrohr 1, 2 und somitischen Zellen in WT- und Tbx6-KO-Embryonen zeigt. c, UMAP zeigt die Projektion von Zellen, die den angegebenen Clustern auf der Rumpfbahn zugeordnet sind (Abb. 3c), wobei die Größe der Punkte den Grad der Unsicherheit der Zuordnung zur jeweiligen Position darstellt. d, Punktdiagramm, das die Expression der angegebenen Gene in den drei Clustern zeigt (Punktgröße ist der Prozentsatz der Zellen pro Cluster; Farbe ist die durchschnittliche normalisierte Expression des Clusters). e, RNA-FISH der angegebenen Gene in einem Querschnitt eines E9.5 WT- und KO-Embryonen. Die gestrichelten Linien im Schema kennzeichnen die AP-Position innerhalb des Rumpfes, aus dem Schnitte gewonnen wurden. Gezeigt wird ein repräsentativer Ausschnitt aus WT- und KO-Embryonen bei E9,5. Das Expressionsmuster wurde in zwei der KO-Experimente mit n > 3 Embryonen pro Experiment verifiziert. Maßstabsbalken, 50 µm. f, Schematische Darstellung der Transkriptionsidentität und Mustercharakteristik der ektopischen Neuralrohre, die ohne Tbx6-Expression entstehen, was ihre widersprüchliche Transkriptionsidentität hervorhebt.

Als nächstes haben wir die Kügelchen mit einer neuralen und somitischen Identität neu gruppiert, um die Unterschiede zwischen den Neuralrohren in den Tbx6-KO-Embryonen genauer zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Neuralrohrzellen anschließend in vier Transkriptionsuntercluster aufgelöst werden, die wir als Neuralleiste, Neuralplatte und zwei Hauptneuralrohrcluster (Neuralrohr 1 und 2, Erweiterte Daten Abb. 10d) bezeichneten71,72,73,74, 75. Als wir die beiden Neuralrohr-Clusterzellen auf WT- und Tbx6-KO-Arrays räumlich zuordneten, stellten wir interessanterweise fest, dass Neuralrohr-1-Zellen in beiden Genotypen dem Zentralrohr zugeordnet waren. Im Gegensatz dazu wurden Neuralrohr-2-Zellen ausschließlich im Tbx6-KO auf beiden Seiten des Zentralrohrs abgebildet, was darauf hindeutet, dass Eileiterrohre durch einen ausgeprägten Transkriptionszustand gekennzeichnet sind (Abb. 5b). Insbesondere weisen Zellen von Eileiterröhren trotz ihrer vorhergesagten neuronalen Identität eine Transkriptionsidentität auf, die zwischen den somitischen und neuralen Zellen liegt (Abb. 5c und erweiterte Daten Abb. 10e, f). Wir beobachteten ein hohes Maß an mesodermalspezifischen Genen, einschließlich Aldh1a2 und Mest (Abb. 5d, e). Gleichzeitig mit der Expression mesodermaler Marker wiesen Zellen, die einer Eileiterröhre zugeordnet waren, eine verringerte oder fehlende Expression klassischer Neuralrohrmuster-Markergene wie Olig2, Gm38103, Sox3, Nkx6-1 und Shh auf (Abb. 5d, e). Dennoch wurde die mesodermale Signatur mit der widersprüchlichen Expression anderer charakteristischer Neuralrohrstrukturierungsgene wie Foxa2 und Pax6 überlagert (Extended Data Abb. 10g)11.

Zusammenfassend hat unsere räumliche transkriptomische Analyse der Eileiterröhren in Tbx6-mutierten Embryonen Zellen identifiziert, die eine gemischte transkriptomische Identität annehmen, die durch die Expression mesodermaler Gene und eine partielle DV-Genexpressionsmusterung gekennzeichnet ist (Abb. 5f).

Wir führten mit Slide-seq eine embryonale räumliche Transkriptomanalyse durch, um die streng regulierten Genexpressionsmuster von etwa 27.000 Genen in sich entwickelnden Embryonen zu Beginn der Organogenese zu entschlüsseln. Die Rekonstruktion digitaler 3D-Embryonen mithilfe von sc3D ermöglichte die quantitative Erforschung von Genexpressionsmustern und -gradienten auf virtueller In-situ-Basis. In Kombination mit der Entwicklung von sc3D-viewer (einem Napari-Plugin)76, einer zugänglichen, interaktiven und benutzerfreundlichen Visualisierungsplattform zur Registrierung und Erkundung räumlicher Genomdaten in 3D, ermöglichen wir die schnelle und nahtlose Erforschung der Zelltypverteilung und der Genexpressionsmuster jede beliebige Entwicklungsachse, einschließlich der Möglichkeit, Gewebe aus anderen räumlichen transkriptomischen Datensätzen zu rekonstruieren.

Räumlich aufgelöste Einzelzellsequenzierungsmethoden entwickeln sich weiterhin rasant37,38,40,77,78,79. Die Zunahme verfügbarer Datensätze erfordert schnellere und präzisere Rechenansätze, um die zusätzlichen räumlichen Informationen optimal nutzen zu können. sc3D trägt zur eingehenden Analyse der Topologie und Geometrie von Genexpressions- und Koexpressionsmustern bei und stellt die Infrastruktur bereit, um mit der Modellierung der Genexpressionsdiffusion und ihrer Interaktion in embryonalen Geweben zu beginnen. Die sc3D-Datenstruktur wurde absichtlich so konzipiert, dass sie der Ausgabe des bildbasierten Zellverfolgungsalgorithmus nahe kommt. Diese Ähnlichkeit erleichtert die Portierung von auf Zellverfolgung basierenden Inter-Sample-Alignment-Algorithmen wie Tardis auf das räumliche transkriptomische Feld31.

Es war schwierig, die Dynamik zu erforschen, mit der sich Transkriptome entwickeln, wenn sich Vorläufer in ihrer räumlichen Verteilung differenzieren. Die Analyse der Differenzierungsverläufe in den embryonalen Gehirn- und Rumpfregionen ergab mehrere diskrete Domänen, in denen Transkriptionsänderungen räumlich konvergieren oder divergieren, was auf eine nichtlineare und gewebespezifische Beziehung hinweist. Wir beobachteten, dass räumlich abhängige Beziehungen häufig mit Regionen verbunden waren, die durch hohe interzelluläre Signalgradienten gekennzeichnet waren. Diese Veränderungen können die Spezifizierung von Unterlinien, die Migration des Vorfahrenpools, die Reifung differenzierter Subtypen oder die Regionalisierung spezifischer Schicksale widerspiegeln. Zusätzliche Studien, die Abstammungsaufzeichnung, räumliche Informationen und transkriptomische Profilierung einzelner Zellen kombinieren, könnten dazu beitragen, den kausalen Zusammenhang zwischen Genexpressionsprogrammen, räumlicher Zuordnung und Zellschicksalspezifikation aufzuklären.

Die transkriptionelle Neuverdrahtung entlang der AP- und DV-Achse des sich entwickelnden Neuralrohrs definiert diskrete Genexpressionsdomänen, die maßgeblich an der Steuerung der zukünftigen zellulären Diversifizierung beteiligt sind16,17,19,20,21,62,63,64. Wir haben mehrere interessante Gene entdeckt, die entlang dieser Achsen regionalisierte Genexpressionsmuster aufweisen, darunter epigenetische und metabolische Regulatoren, die weitere Untersuchungen erfordern, um ihre molekulare Rolle und funktionellen Auswirkungen zu bestimmen.

Als Beispiel für die Nutzung räumlicher Informationen in einem Störungsexperiment haben wir eine detaillierte transkriptomische Charakterisierung der molekularen Identität der ektopischen Neuralrohre bereitgestellt, die in Tbx6-mutierten Embryonen entstehen. Unerwarteterweise wurden in der Vergangenheit als zusätzliche Neuralrohre morphologisch röhrenförmige Strukturen mit unvollständiger Musterung und fortgesetzter Expression mesodermaler Gene identifiziert, die normalerweise mit nichtepithelialen und mesenchymalen Zellidentitäten verbunden sind. Dies deutet auf eine Entkopplung von Transkriptionsprogrammen und morphogenetischen Ergebnissen während der Embryonalentwicklung hin, wobei Signalgradienten, extrazelluläre Matrix und mechanische Hinweise wahrscheinlich eine entscheidende Rolle spielen80. Während mutierte Tbx6-Embryonen einen ausgeprägten und gut charakterisierten Phänotyp aufweisen, können viele andere Gene weniger offensichtliche morphologische Veränderungen verursachen und profitieren daher von einer ähnlichen räumlich-zeitlichen Charakterisierung, um ihre Entwicklungsrollen zu definieren.

Unsere zugängliche Ressource räumlicher transkriptomischer Karten zu Beginn der Organogenese und unterstützender Rechenwerkzeuge wird die weitere Erforschung der Säugetierentwicklung unterstützen. Darüber hinaus könnte der in dieser Studie vorgestellte Rahmen implementiert werden, um eine molekulare räumliche Phänotypisierung vieler zusätzlicher Störungen durchzuführen. Schließlich konnte auf der Grundlage dieser Arbeit durch die Kombination von Abstammungskartierung und Multi-Omic-Analyse eine umfassende Karte des Genregulationsnetzwerks während der Embryogenese entwickelt werden.

Alle in diesem Artikel beschriebenen Experimente entsprechen den einschlägigen ethischen Vorschriften der jeweiligen Institutionen. Alle Versuche wurden vom Landesamt für Gesundheit und Soziales genehmigt. Alle Tierversuche wurden gemäß den vom Max-Planck-Institut für Molekulargenetik genehmigten Tierschutzrichtlinien und -vorschriften (G0243/18-SGr1_G und ZH120) durchgeführt.

WT E8.5-, E9.0- und E9.5-Embryonen wurden aus den Uteri von natürlich gepaarten CD-1-Mäusen in 1 × HBSS (Katalog-Nr. 14175053, Gibco) auf Eis präpariert. Die Embryonen wurden basierend auf Morphologie, Größe und Somitenzahl in Stadien eingeteilt (Stadium mit 3–5 Somitenpaaren für E8.5, Stadium mit 10–12 Somitenpaaren für E9.0 und Stadium mit 15–18 Somitenpaaren für E9.5). Extraembryonales Gewebe wurde vor der Verarbeitung aus E9.5-Embryonen entfernt. Die Embryonen wurden in kaltem 1× HBSS mit 2 U ml-1 RNase-Inhibitor (Katalog-Nr. N8080119, Thermo Fisher Scientific) gewaschen und in OCT-Lösung (Katalog-Nr. 23-730-571 und 23-730-572, Thermo Fisher Scientific) eingebettet ). Embryonen im OCT wurden unter einem Stereoskop ausgerichtet, sofort zum Schockgefrieren auf Trockeneis gelegt und schließlich bei –80 °C gelagert. Tbx6-mutierte Embryonen wurden nach einem zuvor festgelegten Protokoll erzeugt26,68,69,70. Kurz gesagt, in vitro befruchtete (IVF) Zygoten wurden mit dem Alt-R CRISPR-Cas9 RNP-Komplex elektroporiert, wobei die Guides auf drei verschiedene Exons von Tbx6 abzielten (Ergänzungstabelle 10). Embryonen, die sich zum Blastozystenstadium entwickelt hatten, wurden wie beschrieben auf CD-1-pseudoträchtige Ersatztiere übertragen. Alle bei E9.5 isolierten mutierten Tbx6-Embryonen zeigten den mutierten Phänotyp (vergrößerte Schwanzknospe, ektopische Neuralrohre). Die Rumpfregion wurde aus WT- und mutierten Embryonen (entfernte Teile oberhalb der Gliedmaßenknospe und des Herzens) präpariert, in OCT-Lösung eingebettet und bei –80 ° C eingefroren.

Die Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in einzeln belüfteten Käfigen bei 22 ± 2 °C, 55 ± 10 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (6:00–18:00 Uhr) gehalten. Die IVF wurde mit B6D2F1-Oozytenspendern (im Alter von 7–9 Wochen; Envigo) durchgeführt und das Sperma wurde von B6.CAST F1-Männchen (im Alter von 2 Monaten, hausintern durch Zucht von C57BL/6J-Weibchen und CAST/EiJ-Männchen erzeugt) isoliert. Für die Embryotransferexperimente wurden pseudoschwangere weibliche CD-1-Mäuse (Hsd:ICR; 9–12 Wochen alt; 21–25 g; Envigo) mit vasektomierten Männchen (Swiss Webster; älter als 13 Wochen; Envigo) gepaart.

Frisch gefrorene OCT-Blöcke mit Mäuseembryonen wurden in einem Kryostat (CM1950, Leica Biosystems) auf –20 °C äquilibriert, mit OCT auf einen Schneidblock montiert, in 10 μm Dicke geschnitten und dann über sequenzierte räumliche Arrays gelegt und auf diesen geschmolzen33, 39. Sagittale Schnitte ganzer Embryonen wurden in den folgenden Abständen entnommen: E8,5-Embryonen, 30 μm Abstand; E9.0-Embryonen, 20 μm Abstand; und für E9.5 wurden Schnitte aus der Mitte des Volumens von drei unabhängigen Embryonen entnommen. Eine für die Kopfregion und eine für die Brust- und Rumpfregion jedes Embryos (Abb. 1a und Ergänzungstabelle 1). Ein E9.5-Querschnitt der Rumpfregion (hinterer Rumpf, der der Somiten-Neuralrohr-Region entspricht) wurde für WT- und Tbx6-mutierte Embryonen mit einer Schnittdicke von 10 µm gesammelt.

Die RNA-FISH des gesamten Embryos wurde gemäß dem Protokoll von Molecular Instruments mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C fixierte Embryonen wurden dreimal jeweils 10 Minuten lang mit 1 × PBS mit 0,1 % Tween 20 (PBST) bei 4 °C gewaschen. Embryonen wurden in einer ansteigenden Konzentrationsreihe von Methanol + PBST-Waschungen für jeweils 10 Minuten bei 4 °C (25 % Methanol; 50 % Methanol; 75 % Methanol; 100 % Methanol) dehydriert. Embryonen wurden über Nacht oder länger bei –20 °C gelagert. Als nächstes wurden die Embryonen in einer Reihe abnehmender Konzentrationen von Methanol + PBST-Waschungen für jeweils 10 Minuten bei 4 °C rehydriert (100 % Methanol; 75 % Methanol; 50 % Methanol; 25 % Methanol; 100 % PBST). Nach zwei 10-minütigen Wäschen bei 4 °C in PBST wurden die Embryonen 20 Minuten lang bei 4 °C mit 6 % Wasserstoffperoxid (für endogene Peroxidaseaktivität in Blutzellen) gebleicht. Nach zwei Wäschen in PBST für jeweils 10 Minuten bei 4 °C wurden die Embryonen für die angegebene Zeit bei Raumtemperatur mit 10 µg ml-1 Proteinase K (Katalog-Nr. EO0491, Thermo Fisher Scientific) behandelt (E9.5: 10 Minuten). . Nach zwei Wäschen mit PBST für jeweils 15 Minuten wurden die Embryonen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4% PFA nachfixiert und in jedem Schritt dreimal 15 Minuten lang in PBST gewaschen. Anschließend wurden die Embryonen durch einstündiges Inkubieren in Hybridisierungspuffer bei 37 °C für die Hybridisierung vorbereitet. Die Sonden wurden in Hybridisierungspuffer in einer Konzentration von 1 pM resuspendiert und mit Embryonen über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Embryonen wurden viermal mit Sondenwaschpuffer für jeweils 15 Minuten bei 37 °C gewaschen, gefolgt von drei Wäschen in 5× SSCT-Hybridisierungspuffer + 0,1 % Tween 20. Fluoreszierende Haarnadeln wurden wie vom Hersteller beschrieben in einer Konzentration von 0,06 µM hergestellt jede Haarnadel im Amplifikationspuffer. Die Embryonen wurden dann in Amplifikationspuffer inkubiert, bevor sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Haarnadelsonden inkubiert wurden. Überschüssige Sonden wurden durch fünf Waschvorgänge von jeweils 15 Minuten in 5× SSCT bei Raumtemperatur im Dunkeln entfernt. Die Kerne wurden durch Inkubation mit 2 µg ml−1 4,6-Diamidino-2-phenylindol gegengefärbt. Die in dieser Studie verwendeten Puffer und Sondensequenzen sind bei Molecular Instruments erhältlich und ihre eindeutige ID finden Sie in der Ergänzungstabelle 10. Nach der Hybridisierung wurden die Embryonen in OCT eingebettet und bei –80 °C eingefroren. COCT-Blöcke wurden geschnitten, um Querschnitte davon zu erhalten Rumpfregion und Neuralrohr mit einer Dicke von 30 µm. Embryonen und Schnitte wurden mit einem konfokalen ZEISS LSM-880-Mikroskop bei 10-facher und 20-facher Vergrößerung abgebildet, durchschnittlich viermal pro Bild und 10-µm-Z-Stapel. Die Bilder wurden mit der ImageJ-Software verarbeitet. Die Plot-Profile-Funktion wurde verwendet, um die Signalintensität entlang einer benutzerdefinierten Achse für jeden Fluoreszenzkanal durchzuführen.

Zur Generierung aller Sequenzierungsbibliotheken wurde das Slide-seq V2-Protokoll verwendet. Bead-Synthese, Array-Sequenzierung, Bildverarbeitung und Base-Calling wurden wie unten beschrieben durchgeführt33,39. Kurz gesagt, die 10-μm-Barcode-Kügelchen wurden intern von ChemGenes mit einem 14-bp-räumlichen Barcode, getrennt durch eine 14-bp-Linkersequenz, einer 8-bp-UMI-Sequenz (Unique Molecular Identifier) ​​und einem 20-bp-Poly(T ) Schwanz. Die Perlenanordnungen wurden durch Resuspendieren der synthetisierten Perlen in 10 % Dimethylsulfoxid bei einer Konzentration von 20.000–50.000 Perlen pro Mikroliter hergestellt. Anschließend wurden 10 μl der Perlenlösung in jede Position der Dichtung pipettiert. Die mit der Perlenlösung gefüllte Deckglasdichtung wurde bei 750 g für mindestens 30 Minuten bei 40 °C zentrifugiert, bis die Oberfläche trocken war. Um die räumlichen Barcodes zu extrahieren, wurden Arrays unter Verwendung von Bioptechs FCS2-Durchflusszellen mit einer peristaltischen RP-1-Pumpe (Rainin) und einem modularen Ventilpositionierer (Hamilton MVP) sequenziert. Während der Sequenzierung wurden Flussraten zwischen 1 und 3 ml/min verwendet. Die Bildaufnahme erfolgte mit dem Objektiv Nikon Plan Apo 10×/0,45. Die Sequenzierung wurde mithilfe eines Sequenzierungs-durch-Ligation-Ansatzes durchgeführt. Der Basisaufruf aus den Bildern wurde mit dem benutzerdefinierten MATLAB-Paket PuckCaller (https://github.com/MacoskoLab/PuckCaller) durchgeführt.

Das vollständige Protokoll für die Vorbereitung der Slide-seq V2-Bibliothek finden Sie unter https://www.protocols.io/view/library-generation-using-slide-seqv2-81wgb7631vpk/v1?version_warning=no. Kurz gesagt, mit frisch geschnittenen Gewebeschnitten bedeckte Arrays wurden in Röhrchen mit 6 × SSC, ergänzt mit RNAase-Inhibitor (Konzentration 1:20, Katalog-Nr. 30281-2, NxGen, Lucigen), überführt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Arrays wurden dann in 1× Reverse-Transkriptase-Puffer getaucht und dann in Röhrchen übertragen, die den Reverse-Transkriptase-Mix enthielten (Maxima 1× Reverse-Transkriptase-Puffer, 1 mM Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), 2 U ml-1 RNase-Inhibitor, 2,5 mM Template-Switch-Oligonukleotide ( Katalog-Nr. 339414YCO0076714, QIAGEN) und 10 U ml−1 Maxima H minus Reverse Transkriptase) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 90-minütigen Inkubation bei 52 °C. Proteinase K (Konzentration 1:50) und Gewebereinigungslösung wurden in dasselbe Röhrchen gegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Perlen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vom Glasobjektträger entfernt und in TE-TW-Lösung (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,01 % Tween 20) resuspendiert und zwei TE-TW-Waschvorgängen gefolgt von 2 unterzogen -Min. Zentrifugation bei 3000g. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die Perlen in 200 μl Exonuklease-I-Mischung (20 μl 10 × ExoI-Puffer, 10 μl ExoI, New England Biolabs) resuspendiert und 50 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Perlen zweimal in TE-TW gewaschen, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation in 0,1 N NaOH bei Raumtemperatur und einem weiteren TE-TW-Waschvorgang. Die Zweitstrangsynthese wurde an Perlen durchgeführt, indem 200 μl Zweitstrangmischung (Maxima 1× Reverse-Transkriptionspuffer, 1 mM dNTPs, 10 mm dN-SMRT-Oligonukleotide, 0,125 U ml-1 Klenow-Fragment) hinzugefügt und bei 37 °C inkubiert wurden 60 Min. Als nächstes wurden die Perlen dreimal in TE-TW gewaschen, bevor sie mit PCR zur Amplifikation des gesamten Transkriptoms (1 × Terra Direct PCR-Mischpuffer, 0,25 U ml Terra-Polymerase, 2 mM TruSeq PCR-Handle-Primer und 2 mM SMART PCR-Primer) mit amplifiziert wurden folgende Bedingungen: 95 °C 3 min; 4 Zyklen mit 98 °C für 20 s, 65 °C für 45 s, 72 °C für 3 min und 9 Zyklen mit 98 °C für 20 s, 67 °C für 20 s, 72 °C für 3 min und 72 °C C für 5 Min. Das PCR-Produkt wurde durch zweimalige 0,6-fache reversible Immobilisierung an der Festphase gereinigt und auf ein Endvolumen von 10 μl resuspendiert. Anschließend wurde 1 μl der Bibliothek entweder auf einem Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA-Chip oder einem Agilent TapeStation High Sensitivity D500 DNA ScreenTape quantifiziert. Anschließend wurden 600 pg des PCR-Produkts als Input verwendet, um Illumina-Sequenzierungsbibliotheken durch Tagmentierung mit einem Illumina Nextera XT-Kit (Katalog-Nr. FC-131-1096) zu generieren. Die Bibliothek wurde mit TruSeq 5 und einem Barcode-Index der N700-Serie unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 72 °C für 3 Minuten; 95 °C für 30 s; 12 Zyklen von 95 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 30 s und 72 °C für 5 min. Nach der Bereinigung wurden die endgültigen Bibliotheken auf einer NovaSeq S2- oder S4-Durchflusszelle mit etwa 300 Millionen Lesevorgängen pro Array für E8.5_Embryo_1- und E9.5-Embryonen, etwa 200 Millionen Lesevorgängen pro Array für E8.5_Embryo_2 und E9.0 und etwa 50 Millionen Lesevorgängen pro Array sequenziert Lesevorgänge pro Array für WT- und Tbx6-KO-Querschnitte.

Die sequenzierten Lesevorgänge wurden mithilfe der Slide-seq-Tools-Pipeline (https://github.com/MacoskoLab/slideseq-tools) verarbeitet, um die Genzahlmatrix zu generieren und den Bead-Barcode zwischen Array und sequenzierten Lesevorgängen abzugleichen. Der Großteil der Downstream-Analyse wurde in R (v.4.1.0) durchgeführt, mit Ausnahme der RNA-Geschwindigkeitsanalyse, die in Python (v.3.8.3, v.3.9.0, v.3.10) durchgeführt wurde. Die Genzahlmatrix und die räumlichen Koordinaten der Kügelchen wurden mit Seurat (v.3.0.0, v.4.0.2)81 verarbeitet. Perlen mit mehr als 200 Zählungen und weniger als 20 % der mitochondrialen Genzählungen wurden zur weiteren Analyse aufbewahrt. Aufgrund des minimalen Batch-Effekts wurden die Daten aus jeder Phase zusammengeführt und gemeinsam analysiert. Für die E8.5-Replikations- und E9.5-Daten wurden die besten 3.000 hochvariablen Gene in FindVariableFeatures und die besten 40 Hauptkomponenten aus der Hauptkomponentenanalyse (PCA) (RunPCA von Seurat) verwendet. Mit den Funktionen FindTransferAnchors und TransferData wurde die Seurat-Label-Übertragung verwendet, um Zellzustandsanmerkungen zu erhalten. Für das zweite E8.5-Replikat und die E9.0-Daten verwendeten wir Robust Cell Type Decomposition (RCTD)82, um den Zellzustand zu kommentieren, da dieser robuster gegenüber niedrigeren UMI-Zahlen ist. Daten aus der E8.5-Stufe unserer vorherigen Studie wurden als Referenzdaten für die Seurat-Label-Transfer-Funktion und die RCTD-Funktion26 verwendet. Diagramme wurden mit ggplot2 (v.3.1.0) erstellt.

Um ein besseres Verständnis der verschiedenen Zelltypen im Gehirn von E9.5-Embryonen zu erhalten, führten wir ein De-novo-Clustering aus den Perlen durch, die den E9.5-Stufen-Arrays entsprechen, und kommentierten und verfeinerten die Identitäten mithilfe der Seurat-Pipeline (Auflösung = 1). ) und kommentierte jeden der 30 Cluster manuell mit bekannten Markergenen und Markierungsübertragungsergebnissen.

Zunächst kombinierten wir die räumlichen Geschwindigkeiten von Markergenen, um Gene zu identifizieren, die innerhalb der Gehirngrenzen exprimiert werden: Fgf8 für die Grenze zwischen Mittelhirn, Foxg1, Barhl2 und Wnt8b für die Grenze zwischen Telencephalon und Zwischenhirn sowie Barhl2 und Pax6 für die Grenze zwischen Zwischenhirn und Mittelhirn. Als nächstes berechneten wir den Abstand zwischen jeder Perle und den Grenzen und wählten Perlen innerhalb eines Abstands von 300 µm aus. Gene, deren Expression mit der Entfernung zu den Gehirngrenzen korrelierte, wurden mithilfe eines EdgeR (v.3.34.1) Quasi-Likelihood-Modells (glmQLFit-Funktion)83 identifiziert. Die 40 nach FDR am besten bewerteten Gene wurden für die Heatmap-Visualisierung (Complex Heatmap, Version 1.99.5) in Abb. 2c ausgewählt.

Die mit dem sich entwickelnden Auge verbundenen Perlen wurden halbüberwacht identifiziert. Zunächst wurden die mit den bekannten Markergenen Rax, Vax1 und Six6 korrelierten Gene mittels Gen-Koexpressionsanalyse extrahiert. Diese Gene wurden als Input für die PCA- und Clustering-Pipeline in Seurat verwendet; Es wurden die fünf wichtigsten Hauptkomponenten verwendet. Als nächstes verwendeten wir dbscan, um die Clustering-Ergebnisse räumlich zu verfeinern und einige Ausreißer im Augencluster zu entfernen. Anschließend verglichen wir mithilfe der FindMarkers-Funktion den Augencluster mit dem Vorderhirncluster und suchten nach neuen Markergenen, die speziell in den sich entwickelnden Augenregionen exprimiert werden.

Die sc3D-Rekonstruktion und die damit verbundene Analyse werden in den Zusatzinformationen ausführlich beschrieben und sind auch unter https://github.com/GuignardLab/sc3D zu finden.

Wir haben das Paket scVelo (v.0.2.4)84 angepasst, um die RNA-Geschwindigkeit auf der Raumachse zu analysieren. Mithilfe des Tutorials unter https://scvelo.readthedocs.io/ wurden exonische und intronische Zählungen aus jeder Perle aus den Daten extrahiert und als Eingabe verwendet. Das stochastische Modell mit Standardparametern wurde verwendet, um die Geschwindigkeit jeder Perle zu berechnen. Als nächstes wurden die Geschwindigkeitsvektoren auf den physikalischen Raum projiziert. Zur Visualisierung wurden die Geschwindigkeitsvektoren gemäß einem 50 × 50 μm-Raster berechnet; Zur Berechnung der Durchschnittsgeschwindigkeit wurden in jedem Gitter die 50 nächsten Nachbarn ausgewählt. Die Länge der Geschwindigkeit im Hinblick auf die Geschwindigkeit der transkriptomischen Veränderungen wurde berechnet, indem die durchschnittliche Länge des Geschwindigkeitsvektors von den Nachbarn (n = 50) einer Perle genommen wurde. Das Geschwindigkeitsvertrauen repräsentiert die Kohärenz der Geschwindigkeitsrichtung. Sie wurde berechnet, indem die Summe des Kosinuswinkels zwischen dem Geschwindigkeitsvektor und seinen Nachbarn (n = 50) gebildet wurde. Die Funktion rank_velocity_genes wurde verwendet, um Gene zu identifizieren und einzustufen, die zum Vektorfeld beitragen. Dies bedeutet, dass Gene aktiv transkribiert werden und bei der Zelldifferenzierung mehr entstehende mRNA aufweisen.

Als NMPs, Somiten und Neuralrohr bezeichnete Perlen aus E8.5 und E9.5 wurden ausgewählt. Als nächstes wurden Perlen mit einem Vorhersagewert von weniger als 0,6 verworfen, um Zellmischungen zu entfernen. Die verbleibenden Perlen aus E8.5 und E9.5 wurden mit Harmony (v.0.1.0)85 mit Standardparametern integriert; Anschließend wurde eine UMAP-Dimensionalitätsreduzierung (runUMAP) basierend auf einer integrierten Matrix durchgeführt. Als nächstes haben wir Monocle3 (v.1.0.0) verwendet, um die Pseudozeit aus der UMAP-Ausgabe zu berechnen, gemäß dem Tutorial und unter Verwendung von Standardparametern (https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/trajectories/ ). Ein verallgemeinertes lineares Modell mit Quasi-Likelihood-Dispersionsschätzern von edgeR (v.3.34.1)83 wurde verwendet, um die Gene zu finden, die mit der Pseudozeit-Trajektorie korrelierten. Kurz gesagt, wie bei den Tutorial86-Anweisungen haben wir „estimateDisp“ verwendet, um die genweise negativen Binomialstreuungen abzuschätzen, gefolgt von glmQLFit oder glmQLFTest, um Gene zu testen, die signifikant mit dem Pseudozeitwert korrelierten, der als Kovariate in der Designmatrix verwendet wurde. Gene mit einem FDR < 0,01 und einer logarithmischen Faltungsänderung von mehr als 0,05 wurden ausgewählt und in einer Heatmap dargestellt.

Nach der Trajektorienanalyse im Rumpfbereich wurde der paarweise Abstand zwischen den Kügelchen innerhalb jedes Zellzustands auf der Grundlage ihres räumlichen Abstands und ihrer Pseudozeitdifferenz berechnet. Diese Analyse führt zur Generierung einer räumlichen und einer Pseudozeit-Distanzmatrize. Als nächstes wurden der räumliche Abstand und der Pseudozeitabstand jedes Paares verglichen und aufgezeichnet.

Für diese Analyse wurden die Perlen verwendet, denen im Array E9.5_10 eine Neuralrohridentität zugeordnet wurde. Mit Slingshot::slingshot (v.2.0.0)87 haben wir die Hauptkurven aus der räumlichen Position der Perlen berechnet und die Zellen entlang der Hauptkurven nach ihrem Abstand von vorne nach hinten geordnet. Der Abstand jeder Perle zur konvexen Hülle des Neuralrohrs wurde als Abstand von dorsal nach ventral berechnet und in acht gleichmäßig beabstandete Abschnitte aufgeteilt. Wir haben SPARK (v.1.1.1)88 mit Standardparametern verwendet, um räumlich variable Gene zu finden. Wir haben die Schnittmenge der räumlich variablen Gene von SPARK und der variablen Gene von Seurat als Eingabe für die räumliche Modulanalyse verwendet. Dynamische Zeitverzerrung wurde angewendet, um Gene mit kohärenten räumlichen Mustern zu finden, die wir (in der Hox-Genanalyse) als Module definiert haben. Für die Analyse mit der tsclust-Funktion (k = 8) wurde das Paket Dtwclust (v.5.5.6) (https://CRAN.R-project.org/package=dtwclust) verwendet. Der Schwerpunkt jedes Moduls wurde als räumliches Muster berechnet. Als nächstes verwendeten wir dieselbe EdgeR-Pipeline wie bei der Trajektorienanalyse, um mehr Gene zu finden, die mit jedem räumlichen Muster korrelierten. Wir haben Gene mit demselben Schwellenwert ausgewählt und sie in einer Heatmap visualisiert. Die Hox-Gene wurden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben gruppiert und die durchschnittliche Expression jedes Moduls wurde mithilfe der Funktion gam::gam (v.1.2.0) zur Visualisierung geglättet. Um die Proteinklassen zu bestimmen, die in den differenziell und räumlich variablen Genen angereichert sind, haben wir PANTHER (v.17.0)89 verwendet.

Die Daten aus den Transversalschnitten von WT- und Tbx6-mutierten Embryonen wurden aufgrund des geringen Batch-Effekts zusammengeführt und analysiert. Die Neuralrohr- und Somitenregionen wurden basierend auf der Markergenexpression, Zelltypmarkierungen und Gewebemorphologie extrahiert. Aufgrund der geringen Probengröße wurden die extrahierten Perlen mithilfe der Seurat-Pipeline mit unterschiedlichen Parametern verarbeitet. Die verwendeten Parameter waren die folgenden: Wählen Sie 1.000 Gene mit der Funktion FindVariableFeatures aus; Verwenden Sie die ersten 20 Hauptkomponenten in der FindNeighbors-Funktion. und berücksichtigen Sie 15 Nachbarn in der Berechnung des k-nächsten Nachbarn, indem Sie eine Auflösung von 0,8 in der FindClusters-Funktion verwenden und n.neighbors = 20, min.dist = 0,3 in der RunUMAP-Funktion festlegen. Nach der De-novo-Clusterbildung haben wir jeden Cluster mit seinen Markergenen versehen und Cluster 0 ausgeschlossen, da dieser hauptsächlich Perlen von geringer Qualität enthielt. Die Cluster 4 und 5 entsprachen der Neuralleiste bzw. der Neuralplatte, sodass eine weitere Analyse ausgeschlossen war. Wir haben die räumliche Rasterdichte jedes Clusters mit MASS::kde2d (Version 7.3–54) berechnet und sie kombiniert, indem wir für jede Position die höchste Dichte ermittelt haben, die in Abb. 5b dargestellt ist. Wir haben die WT- und Tbx6-Mutantendaten dem E9.5-Stammdatensatz als Referenz zugeordnet, indem wir ihren gegenseitigen nächsten Nachbarn mithilfe der schnellen Korrekturmethode für gegenseitige nächste Nachbarn90 berechnet haben. Für jede Perle in den Tbx6-Mutantendaten haben wir die zehn nächsten Nachbarn im integrierten PCA-Raum als Anker ausgewählt. Wir haben die Varianz der dimensionsreduzierten Matrix von den Nachbarn als Maß für die Projektionsunsicherheit berechnet. Die gemittelten UMAP-Koordinaten der zehn nächsten Nachbarn für jede Perle wurden auf den Referenz-UMAP projiziert, wobei die Größe die Projektionsunsicherheit darstellt. Die Funktion FindAllMarkers wurde verwendet, um die Markergene für jeden Cluster zu finden. Anschließend haben wir die FindMarkers-Funktion angewendet, um zwei Cluster (Somit versus zentrales Neuralrohr und zentrales Neuralrohr versus ektopisches Neuralrohr) mit der Faltungsänderung jedes Gens zu vergleichen.

Alle Versuche, die Beobachtungen zu reproduzieren, waren erfolgreich (siehe unten). Sofern angegeben, wurde eine Vorauswahl der Proben durchgeführt (unten). Sofern in den Methoden nichts anderes angegeben ist, wurden keine Proben oder Daten von der Analyse ausgeschlossen. Alle Vergleiche (Tbx6 KO) wurden mit Kontrollproben aus demselben Experiment durchgeführt. Die Sequenzierung sowie die nachgelagerte Verarbeitung und Analyse erfolgten unabhängig von menschlichem Eingreifen. Die Verblindung war nicht relevant, da es sich nicht um eine Interventionsstudie handelte; Pipelines wurden für alle Proben einheitlich ausgeführt, was eine unvoreingenommene Analyse ermöglichte. Zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen wurden keine statistischen Methoden verwendet, aber unsere Stichproben ähneln denen in früheren Veröffentlichungen29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Zur Identifizierung von Markergenen wurde ein zweiseitiger Wilcoxon-Rangsummentest verwendet, und für die Mehrfachvergleiche in Abb. 2c, Erweiterte Datenabbildungen wurde eine Bonferroni-Korrektur verwendet. 6d und 10f, Ergänzungstabellen 5 und 6 sowie Ergänzungstabellen 8 und 9. Alle anderen Tests sind in den Abbildungslegenden beschrieben. Die verwendeten FDR- und P-Werte (FDR < 0,01 und logarithmische Faltungsänderung größer als 0,05) sind in den Legenden angegeben.

In den erweiterten Daten in Abb. 4c lauten die Elemente in den Boxplots wie folgt: Mittellinie, Median; Boxplot-Grenzen, oberes und unteres Quartil; Schnurrhaare, sd

Die Slide-seq-Experimente mit WT-Embryonen wurden an zwei ganzen E8.5-, einem E9.0- und 13 Teilschnitten von drei Embryonen im E9.5-Stadium durchgeführt. Embryonen wurden aus mindestens drei unabhängigen Isolationsexperimenten gewonnen und auf Somitenzahl untersucht (Stadium mit 3–5 Somitenpaaren für E8.5; Stadium mit 10–12 Somitenpaaren für E9.0; Stadium mit 15–18 Somitenpaaren für E9.5). Dies sind die repräsentativen Embryonen, die in den erweiterten Daten in Abb. 1a gezeigt werden. Das Slide-seq-Experiment mit WT- und Tbx6-KO-Embryonen wurde an einem (WT) und zwei (Tbx6-KO) Transversalschnitten durchgeführt. Das Tbx6-KO-Experiment wurde (insgesamt) fünf Mal unabhängig voneinander durchgeführt, um den Phänotyp zu verifizieren, der in jedem Embryo über alle Experimente hinweg reproduziert wurde. Es wurden Schnitte aus dem hinteren Teil des Rumpfes entnommen (das repräsentative Bild des vor Slide-seq gesammelten Schnitts ist in Abb. 5a dargestellt). Die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung wurde einmal in Embryonen im WT-E9.5-Stadium für die angegebene Anzahl (n = 3) durchgeführt und zeigte reproduzierbare Ergebnisse (Extended Data, Abb. 2b). Die RNA-FISH-Experimente wurden mit zwei der unabhängigen Experimente mit der angegebenen Anzahl (n = 3 Embryonen) durchgeführt und zeigten reproduzierbare Ergebnisse, wobei ein repräsentatives Bild in den Erweiterten Datenabbildungen gezeigt wird. 5c, 7f, 9f und 10g und Abb. 4e und 5e.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohe und verarbeitete Daten können vom Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer heruntergeladen werden. GSE197353. Das Eingabeobjekt für die 3D-Visualisierung für die folgenden Embryonen kann heruntergeladen werden: E8.5_Embryo1 (https://figshare.com/s/1c29d867bc8b90d754d2); E8.5_Embryo2 (https://figshare.com/articles/dataset/E8_5_Embryo2_h5ad/21695849/1); E9.0 (https://figshare.com/articles/dataset/E9_0_Embryo_h5ad/21695879/1). Einzelne Slide-seq-Arrays können unter https://cellxgene.cziscience.com/collections/d74b6979-efba-47cd-990a-9d80ccf29055 visualisiert werden. Sequenzen und Plasmide der Whole-Mount-In-situ-Hybridisierungssonden sind unter http://mamep.molgen.mpg.de verfügbar. Die Zugangsnummern und Sequenzen sind in der Ergänzungstabelle 10 aufgeführt. Die FISH-Sonden-Zugangscodes finden Sie in der Ergänzungstabelle 10. Vollständig Sondensequenzen sind Eigentum von Molecular Instruments. Einzelheiten zu Tutorials und zusätzliche Benutzerinformationen für sc3D finden Sie im Ergänzenden Hinweis.

Der zur Reproduktion der Analysen verwendete Code ist unter https://github.com/GuignardLab/sc3D für die sc3D-3D-Rekonstruktion und unter https://github.com/LuyiTian/Embryo_Slideseq_analysis für die E9.5-Analyse indiziert. Der 3D-Embryo kann mit sc3D-viewer visualisiert werden, indem die detaillierten Anweisungen befolgt werden (https://github.com/GuignardLab/napari-sc3D-viewer). Auf PuckCaller kann unter https://github.com/MacoskoLab/PuckCaller zugegriffen werden.

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Referenzen herunterladen

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Meissner, Chen und Macosko für die kritische Diskussion und das Feedback. Wir danken M. Scholz-Wittler und B. Hermann für die Bereitstellung von Plasmiden aus dem Molecular Anatomy of the Mouse Embryo Project für die In-situ-Hybridisierungsexperimente. Wir danken J. Fiedler, M. Peetz, A. Landsberger und C. Franke von der Abteilung für transgene Tiere des Max-Planck-Instituts für molekulare Genetik für ihre Unterstützung bei Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft (AM) unterstützt. LG erhielt Fördermittel aus dem Programm „Investissements d'Avenir“ der französischen Regierung, das von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-16-CONV-0001) verwaltet wird, und aus der Exzellenzinitiative der Universität Aix-Marseille – A*MIDEX. FC dankt für die Unterstützung des National Institutes of Health Early Independence Award (DP5, 1DP5OD024583), des National Human Genome Research Institute (R01, R01HG010647), des Burroughs Wellcome Fund CASI Award, der Searle Scholars Foundation, des Harvard Stem Cell Institute und des Merkin Institut.

Open-Access-Förderung durch die Max-Planck-Gesellschaft.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Abhishek Sampath Kumar, Luyi Tian, ​​Adriano Bolondi.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Evan Z. Macosko, Léo Guignard, Fei Chen, Alexander Meissner.

Abteilung für Genomregulation, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin, Deutschland

Abhishek Sampath Kumar, Adriano Bolondi, Amèlia Aragonés Hernández, Helene Kretzmer, Maria Walther, Gabriel Barakat, Leah Haut, Yechiel Elkabetz und Alexander Meissner

Institute of Biotechnology, Technische Universität Berlin, Berlin, Germany

Abhishek Sampath Kumar

Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Luyi Tian, ​​Robert Stickels, Evan Murray, Evan Z. Macosko, Fei Chen und Alexander Meissner

Institute of Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Amelia Aragonés Hernández, Leah Haut und Alexander Meissner

Graduate School of Arts and Sciences, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Robert Stickels

Abteilung für Entwicklungsgenetik, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin, Deutschland

Lars Wittler

Abteilung für Psychiatrie, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA

Evan Z. Macosko

Universität Aix Marseille, Universität Toulon, Nationales Zentrum für wissenschaftliche Forschung, Labor für Informatik und Systeme 7020, Turing-Zentrum für lebende Systeme, Marseille, Frankreich

Leo Guignard

Abteilung für Stammzellen- und Regenerative Biologie, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Fei Chen & Alexander Meissner

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ASK, AB, EZM, FC und AM konzipierten die Studie. ASK, LT und RS führten die Slide-seq-Experimente mit Hilfe von AB durch und EMLT führte die Datenanalyse mit Hilfe von ASK, HK, AB und AAHAAH durch und YE lieferte kritisches Feedback zur Analyse der Gehirnregionen. LG konzipierte, entwickelte und überwachte die 3D-Rekonstruktion und -Analyse. ASK und LW führten die transgenen Tierversuche durch. ASK führte die In-situ-Hybridisierung und RNA-FISH-Experimente mit Hilfe von MW, GB durch und LHAM, FC und EZM überwachten die Studie. ASK, AB und AM haben das Manuskript mit kritischem Input aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Alexander Meissner.

EZM und FC sind bezahlte Berater von Atlas Biologicals. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Genetics dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

A. Hellfeldbilder repräsentativer Embryonen, die aus drei unabhängigen Pflegemäusen isoliert und für die jeweiligen Entwicklungsstadien inszeniert wurden. Maßstabsbalken, 500 µm. B. Verteilung der von Slide-seq profilierten Perlen aus den jeweiligen Phasen. C. Violindiagramme, die die Anzahl der pro Perle wiederhergestellten UMIs oder Gene zeigen. Log10-Werte werden zur Darstellung von Zählungen verwendet. UMI, einzigartiger molekularer Identifikator. D. Violindiagramme, die die Anzahl der pro Perle über einzelne Arrays wiederhergestellten UMIs und Gene zeigen. Log10-Werte werden zur Darstellung von Zählungen verwendet. UMI, einzigartiger molekularer Identifikator. e. Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) von Slide-seq-Daten und 10X scRNA-seq-Referenzatlas der Maus-Gastrulation26. Die Farbe der Perlen entspricht dem vorhergesagten und kommentierten Zellzustand. Einschub: UMAP-Darstellung der Perlen, die von den angegebenen Modalitäten abgedeckt werden (rot). Jeder Punkt repräsentiert eine Perle oder eine Zelle. F. UMAP integrierter Daten der Stufen E6.5 bis E9.5. Schwarze Perlen stellen Zellen/Perlen aus dem entsprechenden Stadium dar. Jeder Punkt repräsentiert eine Perle oder eine Zelle.

A. Repräsentatives Rumpf-/Thorax-Array (Array E9.5_2) mit hervorgehobenen, räumlich projizierten Zellzuständen. Jeder Punkt stellt eine Perle dar. Umrisse werden verwendet, um morphologische Merkmale hervorzuheben. A, anterior; P, hinten; D, dorsal; V, ventral. Maßstabsbalken, 200 μm b. Vergleich von Slide-seq und konventioneller Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung für Genexpressionsmuster. Räumliches Genexpressionsdiagramm, das die Expression von Ttn (Herz), Sox2 (Neuralrohr), T (Schwanzknospenmesoderm) und Meox1 (Somiten) zeigt. Die Farbskala zeigt die normalisierte Genexpression. n/n im Whole-Mount-In-situ-Hybridisierungspanel gibt die Anzahl der Embryonen an, die das Muster aufweisen, im Vergleich zur Gesamtzahl der untersuchten Embryonen (aus einem Experiment). Jeder Punkt stellt eine Perle dar. Maßstabsbalken, 200 μm. C. Zellstatusverteilung der annotierten Cluster in den einzelnen E9.5-Arrays. Farben repräsentieren einzelne Zellzustände, Legende in Panel (d). D. Räumliche Projektion annotierter Zellzustände in E9.5-Embryo-Arrays. Das Panel zeigt Arrays, die den Rumpf-/Brust- und Kopfbereich abdecken. Jede Farbe entspricht einem bestimmten Zellzustand. Jeder Punkt stellt eine Perle dar. Maßstabsbalken, 200 μm. A, anterior; P, hinten; D, dorsal; V, ventral; R, rostral; C, kaudal. e. Zellzustandsverteilung der annotierten Cluster in einzelnen Arrays der beiden unabhängig voneinander profilierten gesamten Embryonen im E8.5-Stadium. Farben repräsentieren einzelne Zellzustände gemäß der Legende in Tafel (d). F. Zellzustandsverteilung einzelner Zustände in 10X scRNA-seq-Referenz26 und Slide-seq im E8.5-Stadium (linkes Feld) und der Vergleich zwischen den beiden gesamten E8.5-Embryonen, profiliert durch Slide-seq (rechtes Feld).

a, b. Räumliche Projektion der Zellzustände in einzelnen Arrays der beiden gesamten E8.5-Embryonen. Jeder Punkt entspricht einer Perle. Jede Farbe repräsentiert einen Zellzustand. Maßstabsbalken, 200 μm. CD. Volumina der angegebenen Gewebe, geordnet vom größten zum kleinsten, berechnet aus dem virtuellen 3D-Embryo E8.5 und E9.0. Die Gewebevolumina sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. e. Relatives Volumen jedes Gewebes in den beiden gesamten E8.5-Embryonen. F. Unstimmigkeit zwischen den anfänglichen und übersprungenen Slices, wenn der Abstand zwischen einzelnen Slices vergrößert wird.

a, b. Vergleich von Genauigkeit und Verarbeitungszeit (sc3D vs. PASTE) über verschiedene Datensätze hinweg. C. Boxplot der paarweisen Abstände zwischen den Perlen in den korrekt registrierten Bildern und denen, die vom Algorithmus generiert werden, wenn die Schichten 60, 90, 120, 150, 180, 210 µm voneinander entfernt sind ('n' Schichtpaare: 6,4,3,3). ,2,1). Boxplot-Elemente: Mittellinie, Median; Boxplot-Grenzen, oberes und unteres Quartil; Whiskers, Standardabweichung. D. Balkendiagramm der Überlappung lokalisierter Gene über Gewebe hinweg in den beiden einzelnen ganzen E8.5-Embryonen. Eine vollständige Liste der Gene finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. e. Balkendiagramm des Anteils der lokalisierten Gene in den einzelnen 2D-Arrays, die zu den zehn am besten bewerteten lokalisierten Genen im 3D-Volumen der jeweiligen Gewebe über alle Gewebe im E8.5-Embryo gehörten (dargestellt ist die Analyse für E8.5_Embryo_1). Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Gene zwischen den 2D-Scheiben und dem 3D-Volumen an (n = 13 Gene). fg. Heatmap der am häufigsten lokalisierten Gene (Reihen-Z-Score-Normalisierung) in den angegebenen Geweben im Embryo E8.5_1 (f) und E9.0 (g).

A. 3D-Ansicht des E8.5-Embryos mit Hervorhebung des Herzgewebevolumens (in Rosa). Jeder Punkt entspricht einer Perle. Der Standpunkt wird durch das Augensymbol (gelb oder blau) gekennzeichnet. B. Streudiagramm, das die am häufigsten lokalisierten Gene im Herzgewebevolumen zeigt. Die Farbskala entspricht einem Lokalisierungswert im Bereich von 0,06 (hellrot) bis 0,30 (dunkelrot). Jeder Punkt repräsentiert ein Gen. Die räumliche Lokalisierung der hervorgehobenen Gene ist in c dargestellt. Die x-Achse zeigt die Dichte der Genexpression und die y-Achse zeigt das relative Expressionsvolumen im Gewebe. C. vISH der lokalisierten Gene Nppa, Cck, Sfrp5 und Tdgf1. Die Farbskala gibt die normalisierten Genexpressionswerte an, die für jedes Gen vom Minimum bis zum Maximum reichen. Jeder Punkt entspricht einer Perle. Der Standpunkt wird durch das Augensymbol (gelb oder blau) gekennzeichnet. RNA-FISH im E9.0-Embryo zeigt die deutliche Lokalisierung von Tdgf1 im Herzen. Maßstabsbalken, 100 µm. D. vISH zeigt die Genkoexpression für Cck (magenta) und Sfrp5 (grün) im Herzgewebe. Jeder Punkt entspricht einer Perle. Die Farbskala für jedes Gen reicht von Schwarz bis Magenta oder Schwarz bis Grün. Doppelt positive Perlen werden in Weiß angezeigt. e. vISH für räumlich allgegenwärtige Gene im Zustand „Urblutspät“. Maßstabsbalken, 200 µm. A, anterior; P, hinten; D, dorsal; V, ventral; L, links; R, richtig.

A. Räumliches Diagramm der annotierten Cluster/Zustände in der Gehirnregion eines Embryos im E9.5-Stadium (Array E9.5_5). Jeder Punkt entspricht einer Perle. Jede Farbe repräsentiert den kommentierten Zellzustand. Maßstabsbalken, 200 µm. B. Räumliches Genexpressionsdiagramm, das die angegebenen Gene der genannten Kategorien darstellt. Jeder Punkt stellt eine Perle dar. Die Farbskala zeigt die normalisierte Genexpression. Maßstabsbalken, 200 µm. Das angezeigte Array ist E9.5_3. C. Punktdiagramm, das die Expression von Genen des Mittel- und Hinterhirns zeigt (annotiert25 in den Clustern des Mittel- und Hinterhirns in dieser Studie). Die Größe des Punkts stellt den Prozentsatz der Zellen dar, die die Gene exprimieren, und die Farbe gibt die normalisierte Genexpression an. D. Vulkandiagramm der unterschiedlich exprimierten Gene zwischen dem annotierten Mittel- und Hinterhirn (diese Studie). Jeder Punkt stellt ein Gen dar, graue Punkte liegen unter der Signifikanzschwelle (Gene gefiltert nach FDR < 0,01 und logFC > 0,2; zweiseitiger Wilcoxon-Laufsummentest). e. Schematisches und räumliches Ausdrucksdiagramm zur Unterscheidung der dorsalen und ventralen Zwischenhirn-/Mittelhirnregionen. Shh markiert die ventrale Domäne, während Fzd10 (Wnt-Rezeptor) den dorsalen Teil markiert. Jeder Punkt stellt eine Perle dar. Die Farbskala zeigt die normalisierte Genexpression. Maßstabsbalken, 100 µm. D, dorsal; V, ventral; R, rostral; C, kaudal.

A. Die Länge der Raumgeschwindigkeit (links) und die Konfidenz der Direktionalität (rechts) heben Regionen mit unterschiedlicher Dynamik hervor. Maßstabsbalken, 200 µm. Das angezeigte Array ist E9.5_3. B. Die Kombination der Längen- und Konfidenzmessung führt zu „niedrigen“ und „hohen“ Geschwindigkeitsbereichen. Regionen mit „niedriger“ Geschwindigkeit weisen eine geringere Länge und eine geringere Richtungsabhängigkeit auf. Regionen mit „hoher“ Geschwindigkeit weisen eine höhere Länge und Richtung des Vektors auf. Der Maßstabsbalken beträgt 200 µm. Das angezeigte Array ist E9.5_3. C. Eingefügte Regionen der RNA-Geschwindigkeit in der Gehirnregion mit Expression von Markern, die die jeweiligen Grenzregionen definieren (repräsentativ für 3 unabhängige E9.5-Arrays). Jeder Punkt entspricht einer Perle. Die Farbskala bezeichnet den normalisierten Ausdruck. Maßstabsbalken, 50 µm. D. Räumliches Diagramm der WNT-Gene bei R2 (Telencephalon-Zwischenhirn-Grenze – markierte Pfeile; repräsentativ für 3 unabhängige E9.5-Arrays). Jeder Punkt entspricht einer Perle. Die Farbskala bezeichnet den normalisierten Ausdruck. Maßstabsbalken, 50 µm. e. Diasequenzbasiertes Schema des sich entwickelnden Auges. Das Vorderhirn (dunkelblau) und das Auge (orange) werden mit dem Anteil der Perlen dargestellt, der jedem Zustand entspricht (Balkendiagramm). 1499/4824 Perlen für das Vorderhirn/vorderes Neuralrohr; 105/4824 Perlen für das Auge/vorderes Neuralrohr; und 105/1499 Perlen für Auge/Vorderhirn. Räumliches Diagramm, das den Ausdruck des augenspezifischen Markers Six6 zeigt. A, anterior; R, rostral; C, kaudal; D, dorsal; V, ventral. F. Räumliche Diagramme, die die Expression von zwei neu identifizierten Augenmarkergenen, Cp und Vwc2, zeigen (links: gesamtes E9.5_3-Array; Mitte: Teilmenge des „Auges“; rechts: RNA-FISH-Validierungen für Cp und Vwc2 (Magenta) und gegengefärbte Kerne (grau) werden für einen repräsentativen Embryo angezeigt. n = 3 Embryonen/Experiment, 3 unabhängige Experimente). Maßstabsleiste, 200 µm. R, rostral; C, kaudal; D, dorsal; V, ventral.

A. Räumliches Diagramm, das Perlen aus dem E9.5-Embryo (Array E9.5_6) zeigt, die den NMPs, PSM, Somiten und Neuralrohrclustern entsprechen (linkes Feld) und die entsprechenden Pseudozeitwerte (rechtes Feld). Jeder Punkt entspricht einer Perle. Zellzustände werden in den angegebenen Farben hervorgehoben. Maßstabsbalken, 200 µm. B. Heatmap, die die Expression pseudozeitbestimmender Gene entlang der somitischen und neuronalen Trajektorien zeigt. Die für die Heatmap verwendeten Gene sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt. c. Liniendiagramm, das die Genexpression ausgewählter Gene entlang der neuralen und somitischen Trajektorien zeigt. Die y-Achse stellt die skalierte Genexpression dar. D. Schematischer Arbeitsablauf des Tools „Achsenprofilierung“. e. Kreisdiagramm mit unterschiedlich exprimierten Genen entlang der anteroposterioren Achse, unterteilt nach zellulärer und molekularer Funktion. Die Gene sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. f. Liniendiagramm, das die räumliche Verteilung entlang der anterior-posterioren Achse des Ausdrucks der Hox-Module (I-VI) zeigt. G. vISH für Hox-Gene im virtuellen 3D-Embryo im E9.0-Stadium. Maßstabsbalken, 200 µm. D, dorsal; V, ventral; A, anterior; P, hinten.

A. Heatmap, die die 160 wichtigsten Gene mit Regionalisierung der Genexpression in einem der acht generierten Bins entlang der dorsoventralen Achse zeigt (Gene gefiltert nach FDR < 0,01 und logFC > 0,05, dann nach FDR geordnet). Ein ausgewählter Satz zuvor bekannter Gene, die mit der dorsoventralen Musterung (schwarz) assoziiert sind, ist rechts hervorgehoben. Spezifische Strukturen entlang der Achse werden unten in der Heatmap hervorgehoben. Die Gene sind auf den Zeilen-Z-Score normalisiert und in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. b. Heatmap mit spaltenskaliertem Z-Score der Pearson-Korrelationskoeffizienten im Vergleich der dorsoventralen Slide-seq-Bins und der identifizierten Cluster aus einer Neuralrohr-Einzelzellreferenz26. RP, Dachplatte; dp, dorsale Vorläufer; pMN, Motoneuron-Vorläufer; FP, Bodenplatte. C. Heatmap, die eine erweiterte Teilmenge der Gene zeigt, die eine Regionalisierung der Genexpression in einem der acht generierten Bins entlang der dorsoventralen Achse zeigen (Gene gefiltert nach FDR < 0,01 und logFC > 0,05, dann nach FDR geordnet). Spezifische Strukturen entlang der Achse werden unten in der Heatmap hervorgehoben. Die Gene sind auf den Zeilen-Z-Score normalisiert und in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. d. Kreisdiagramm mit unterschiedlich exprimierten Genen entlang der dorsoventralen Achse, unterteilt nach zellulärer und molekularer Funktion. Gene sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. e. Schematische (obere Tafel) und räumliche Genexpressionsdiagramme der bekannten Neuralrohrmusterungsgene in Array E9.5_2. Jeder Punkt bezeichnet eine Perle. Die Farbskala zeigt die normalisierte Genexpression. D, dorsal; V, ventral; A, anterior; P, hinten. F. RNA-FISH- und Slide-seq-Quantifizierungen für jedes profilierte Gen aus Abb. 4e. Gene sind Bin-Z-Score-normalisiert (Magenta: RNA-FISH; Orange: Slide-seq). D, dorsal; V, ventral.

A. Schematische Darstellung der Tbx6-Gen-Ablationsstrategie. Guide-RNAs zielen auf die angegebenen Exons. UTR, nicht übersetzte Region. B. Schematische Darstellung der Kryoschnittebene für das Slide-seq-Experiment. C. Räumliches Diagramm aller Zellzustände in den kompletten WT- und Tbx6-KO-Stamm-Transversal-Arrays. Gepunktete Linien kennzeichnen den Bereich, der für die weitere Analyse verwendet wurde. Jeder Punkt entspricht einer Perle. Jede Farbe repräsentiert einen individuellen Zustand. Maßstabsbalken, 200 µm. D. UMAP, räumliches und Bruchdiagramm, das die gefilterten und de novo annotierten Zellzustände zeigt. e. Punktdiagramm, das die Expression von Neuralrohr- und Somiten-Markergenen in den Somiten, Neuralrohr-1- und Neuralrohr-2-Clustern darstellt. Die Größe der Punkte stellt den Prozentsatz der Zellen dar, die das Gen exprimieren, und die Farbe stellt das durchschnittliche normalisierte Expressionsniveau des Clusters dar. F. Streudiagramm, das unterschiedlich exprimierte Gene zwischen Clustern von Somiten und zentralen Röhren sowie Clustern von zentralen und ektopischen Röhren zeigt (Gene gefiltert nach FDR < 0,01. Vollständige Liste der Gene in der Ergänzungstabelle 9. g. RNA-FISH von Foxa2 und Pax6 in einem Querschnitt der Neuralrohr in WT- und Tbx6-KO-Embryonen. Das Schema stellt die anteroposteriore Position dar, an der die Querschnitte profiliert wurden. Maßstabsbalken, 50 µm. D, dorsal; V, ventral; WT, Wildtyp; KO, Knockout.

Ergänzende Abbildungen. 1 und 2, Methoden und Hinweise zur verfügbaren Datenvisualisierung.

Ergänzungstabellen 1–10.

3D-Ansicht von E8.5_Embryo1.

3D-Ansicht von E8.5_Embryo2.

3D-Ansicht von E9.0.

vISH und Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung lokalisierter Gene (Herz und Gehirn) in E8.5_Embryo2.

3D-vISH lokalisierter Gene im Herzen im E8.5-Embryo_1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sampath Kumar, A., Tian, ​​L., Bolondi, A. et al. Raumzeitliche transkriptomische Karten ganzer Mausembryonen zu Beginn der Organogenese. Nat Genet 55, 1176–1185 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01435-6

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Eingegangen: 10. Februar 2023

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juli 2023

Ausgabedatum: Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01435-6

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